第八章 核素示踪在DNA测序中的应用.ppt

  1. 1、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。。
  2. 2、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载
  3. 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
10月21日出版的《自然》杂志一期发表的报告说,人类基因数目为20000-25000,大大低于两三年前左右所估计的30000,更大大低于10年前左右所估计的10万。 ;INTERNATIONAL HUMAN GENOME SEQUENCING CONSORTIUM Nature 431, 931 - 945/21 October 2004 ;The current genome sequence contains 2.85 billion nucleotides interrupted by only 341 gaps. It covers 99% of the euchromatic genome and is accurate to an error rate of 1 event per 100,000 bases. Many of the remaining euchromatic gaps are associated with segmental duplications and will require focused work with new methods.;The near-complete sequence, the first for a vertebrate, greatly improves the precision of biological analyses of the human genome including studies of gene number, birth and death. Notably, the human genome seems to encode only 20,000–25,000 protein-coding genes. The genome sequence reported here should serve as a firm foundation for biomedical research in the decades ahead. ;第一节 基因组测序技术;二??? 测序的基本方法 在分子生物学研究中,DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。 用于测序的技术主要有Sanger等(1977)发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert(1977)发明的化学降解法。 异同点:这二种方法在原理上差异很大,但都是根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,产生A,T,C,G四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测,从而获得DNA序列。 ;(一)Maxam-Gilbert的化学降解测序法 基本原理:用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段,造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物,经凝胶电泳分离和放射自显影之后,可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。 ;测序步骤: ①先用限制性内切酶把DNA切成100~200bp 的测序材料; ②用碱性磷酸化酶处理该片段,消除5′末端上的磷酸; ③在5′-OH端标记32P,用多核苷酸磷酸激酶催化; ④标记片段变性为单链; ⑤化学试剂在特定碱基位置降解单链DNA, 产生一组长度不等的DNA片段; ⑥经电泳和放射性自显影后,从4个反应系统统一阅读, 待测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出。 ;Maxam-Gilbert测序法的特异断裂;G反应: DMS使鸟嘌呤的7位氮原子甲基化,其后断开第8位碳原子和第9位氮原子间的化学键,哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。 G+A反应: 甲酸使嘌呤环上的氮原子质子化,削弱了腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸中的糖苷键,然后哌啶置换了嘌呤。 T+C反应: 肼断开了嘧啶环,产生的碱基片段能被哌啶所置换。 C反应: 在NaCl存在时,只有C才能与肼发生反应,随后被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。;5ˊP;;;改进的特异化学切割反应;(2) 优缺点 A、优点 a、所测的序列来自原有的DNA分子,因此可以分析原分子中象甲基化一类的DNA修饰。它可以通过化学保护和修饰干扰,研究DNA的二级结构和DNA与蛋白质之间的作用; b、测序反应不受DNA二级结构的影响; c、因不需要通过引物,对测定较短的DNA序列,则不必亚克隆到其他适当的载体中,可直接使用含目的DNA的重组子; 测定短的寡核苷酸序列。 ;B、缺点 a、需要一个末端标记的片段并需要凝胶电泳分离,方法比较复杂,花费时间较多,而且经凝胶电泳后往往损失大量的放射性标记片段; b、由于末端标记DNA的比活性低,必须用32P而不能用35S,故所得DNA带放射性扩散作用强,使分辨率降低,而且DNA样品易被放射衰变破坏,不能久放; c、测序范围为

文档评论(0)

麻将 + 关注
实名认证
内容提供者

该用户很懒,什么也没介绍

1亿VIP精品文档

相关文档