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10月21日出版的《自然》杂志一期发表的报告说,人类基因数目为20000-25000,大大低于两三年前左右所估计的30000,更大大低于10年前左右所估计的10万。 ;INTERNATIONAL HUMAN GENOME SEQUENCING CONSORTIUM Nature 431, 931 - 945/21 October 2004 ;The current genome sequence contains 2.85 billion nucleotides interrupted by only 341 gaps. It covers 99% of the euchromatic genome and is accurate to an error rate of 1 event per 100,000 bases.
Many of the remaining euchromatic gaps are associated with segmental duplications and will require focused work with new methods.;The near-complete sequence, the first for a vertebrate, greatly improves the precision of biological analyses of the human genome including studies of gene number, birth and death.
Notably, the human genome seems to encode only 20,000–25,000 protein-coding genes. The genome sequence reported here should serve as a firm foundation for biomedical research in the decades ahead. ;第一节 基因组测序技术;二??? 测序的基本方法
在分子生物学研究中,DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。
用于测序的技术主要有Sanger等(1977)发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert(1977)发明的化学降解法。
异同点:这二种方法在原理上差异很大,但都是根据核苷酸在某一固定的点开始,随机在某一个特定的碱基处终止,产生A,T,C,G四组不同长度的一系列核苷酸,然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测,从而获得DNA序列。 ;(一)Maxam-Gilbert的化学降解测序法
基本原理:用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段,造成碱基的特异性切割并产生一组具有不同长度的DNA链降解产物,经凝胶电泳分离和放射自显影之后,可直接读出待测DNA片段的核苷酸序列。
;测序步骤:
①先用限制性内切酶把DNA切成100~200bp 的测序材料;
②用碱性磷酸化酶处理该片段,消除5′末端上的磷酸;
③在5′-OH端标记32P,用多核苷酸磷酸激酶催化;
④标记片段变性为单链;
⑤化学试剂在特定碱基位置降解单链DNA, 产生一组长度不等的DNA片段;
⑥经电泳和放射性自显影后,从4个反应系统统一阅读, 待测DNA的全部核苷酸序列就可直接读出。 ;Maxam-Gilbert测序法的特异断裂;G反应: DMS使鸟嘌呤的7位氮原子甲基化,其后断开第8位碳原子和第9位氮原子间的化学键,哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。
G+A反应: 甲酸使嘌呤环上的氮原子质子化,削弱了腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸中的糖苷键,然后哌啶置换了嘌呤。
T+C反应: 肼断开了嘧啶环,产生的碱基片段能被哌啶所置换。
C反应: 在NaCl存在时,只有C才能与肼发生反应,随后被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。;5ˊP;;;改进的特异化学切割反应;(2) 优缺点
A、优点
a、所测的序列来自原有的DNA分子,因此可以分析原分子中象甲基化一类的DNA修饰。它可以通过化学保护和修饰干扰,研究DNA的二级结构和DNA与蛋白质之间的作用;
b、测序反应不受DNA二级结构的影响;
c、因不需要通过引物,对测定较短的DNA序列,则不必亚克隆到其他适当的载体中,可直接使用含目的DNA的重组子;
测定短的寡核苷酸序列。 ;B、缺点
a、需要一个末端标记的片段并需要凝胶电泳分离,方法比较复杂,花费时间较多,而且经凝胶电泳后往往损失大量的放射性标记片段;
b、由于末端标记DNA的比活性低,必须用32P而不能用35S,故所得DNA带放射性扩散作用强,使分辨率降低,而且DNA样品易被放射衰变破坏,不能久放;
c、测序范围为
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