5第五章亲合组织化学技术介绍.pptVIP

第五章 亲合组织化学技术;发展历史;植物凝集素(Lectin) 生物素(Biotin) 葡萄球菌A蛋白(SPA) SPA—HRP法、ABC法和LAB法等。;一 抗生物素—生物素免疫细胞化学技术 二 葡萄球菌蛋白A技术 三 凝集素组织化学技术 四 其它亲和细胞化学;一、抗生物素—生物素免疫细胞化学技术;（二）几种亲合素—生物素染色技术 ;; ⑴ 基本原理 是将亲合素作为“桥”与生物素化的抗体与生物素结合的酶（HRP)连接起来。 第一抗体：为未标记特异性抗体，能结合组织中待测抗原； 第二抗体：为生物素化的桥抗体，能与第一抗体结合； 第三抗体：是结合了过氧化物酶的亲合素复合物(即ABC) 。;⑵ 操作步骤 ① 冰冻切片或石蜡切片均可。 ② 冰冻切片：丙酮固定，PBS 洗5min，更换3次。 石蜡切片：脱蜡，系列酒精至水。 ③ 第一抗体孵育，过夜。 ④ PBS洗5min，更换3次。 ⑤ 加生物素标记的第二抗体，孵育15min。 ;(4) 注意事项 ;;SABC试剂盒(含正常血清，生物素化二抗，SABC等); 7）滴加生物素化二抗，20—37℃20分钟。PBS(pH7.2—7.6)洗2分钟×3次。 8）滴加试剂SABC，20—37℃20分钟。PBS(pH7.2—7.6)洗5分钟×4次。 9）DAB显色：使用DAB显色试剂盒。取1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各1滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5一30分钟之间。蒸馏水洗涤。 10）苏木素轻度复染。脱水，透明，封片。显微镜观察。 结果 棕褐色为阳性结果，而细胞核染为淡蓝色。; 注意事项 1）染色背景过高： 在SABC反应之后，DAB显色之前，用加有0.0l一0.02％TWEEN20的PBS(pH7.2—7.6)洗涤切片4次，单纯PBS洗2次，然后DAB显色。 2）抗原热修复：可选0.01M枸橼酸盐缓冲液； 也可以使用PBS、TBS等多种缓冲液。 ;3 标记生物素—抗生物素技术(LAB);SP法（过氧化物酶标记的链霉卵白素/过氧化物酶标记的碱性磷酸酶染色）;三步法（以SP试剂盒为例）　　? 石蜡切片脱蜡至水。　　? 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。　　? 3%H2O2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗，2分钟×3次。　　? 5-10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1-2小时或4℃过夜。　　? PBS冲洗，2分钟×3次。　　? 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10-30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10-20分钟。　　? PBS冲洗，2分钟×3次。　　? 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10-30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10-20分钟。　　? PBS冲洗，2分钟×3次。　　? 显色剂显色（DAB或AEC）。　　? 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。;原理： 将二抗和酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体 优点： 1 简便、快速、敏感性是SP、SABC法的几十倍。 2 人体组织中不含有这种多聚物，从而避免了组织中生物素的干扰 缺点： 因大分子穿透核膜困难, 对于核内抗原的定位不能选用此法。;EnVision工作程序：1） 脱蜡、水化组织切片。2） 预处理组织切片（据一抗具体说明而定）3） 蒸馏水漂洗，置于PBS中。4） 阻断内源性过氧化物酶（仅用于EnVisionTM/HRP）5） 蒸馏水漂洗，置于PBS，10分钟6） 一抗孵育10-30分钟7） PBS漂洗10分钟8） EnVisionTM孵育10-30分钟9） PBS漂洗10分钟10) 色源底物溶液孵育10分钟11) 蒸馏水漂洗12) 复染及封片;CSA法（催化信号放大法）;二、葡萄球菌蛋白A技术; SPA应用:1 免疫球蛋白的制备和分析能和IgG及其某些Fc段结合，可提纯、分析免疫球蛋白制剂。2 应用于免疫细胞化学结合力是双价的，可作为桥抗体或标记抗体。且不受种属特异性限制；分子量小，穿透力强。3 应用于多种细菌、支原体和病毒的简易快速诊断SPA菌体为载体，结合特异性抗体成为一种吸附原，作协同凝集素，用于细菌、病毒的定群和分型。4 可作为固相吸附剂研究免疫复合物、膜抗原、膜受体和膜Ig ;SPA在免疫细胞化学染色中的应