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凝胶层析实验讲稿 第  PAGE 5 页 ，共  NUMPAGES 5 页 凝胶过滤法原理： 液相色谱法是分离纯化的一种重要方法，在多肽、蛋白质及天然生物制品的分离纯化工艺中早已获得应用。近年来随着制药工业、合成化学和生物技术领域新要求的提出，以获取纯产品为目的制备色谱获得蓬勃发展。制备色谱还在分子生物学中显示出优异的性能，在生物工程下游技术中发挥越来越重要的作用，它已经走出实验室投入到大规模的工业化生产中。常用的方法有凝胶层析、离子交换层析、疏水层析和亲和层析等。 凝胶过滤（gel?filtration），又称为凝胶层析（gel?chromatography）、分子筛过滤（molecular??sieve?filtration）等。它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术，广泛应用于酶、蛋白质、核酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离纯化。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。  凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。网眼里吸满水后，凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。这样将分离物质按分子大小的不同分离开。  用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio–gel）及具有一定网眼的细玻璃珠等。 我们主要学习葡聚糖凝胶。由于葡聚糖凝胶基本上不带电荷呈惰性，不与被分离物质发生反应，所以分离的效果较好。 本实验就是通过凝胶层析，首先用浓度为10mg/mL的蓝色葡聚糖-2000测试凝胶柱均匀性，然后分离牛血清白蛋白和氯化钴的混合液。即在层析柱中加入含有牛血清白蛋白和氯化钴的溶液，在凝胶柱上形成一个暗红色区带，随着时间推移，牛血清白蛋白和氯化钴逐渐分开，牛血清白蛋白和蓝色葡聚糖在前（蓝色区带），氯化钴在后（粉色区带），从而达到分离的目的。 本实验操作简便，直观性强，趣味性浓，通过肉眼观察即可检验分离效果。 目的要求： 1学习和掌握分子筛凝胶层析法的工作原理和基本操作技术，其中包括凝胶溶胀、装柱、加样和洗脱等。 2 通过牛血清白蛋白脱盐的实验，学习应用该法分离蛋白质的一般原理，以及了解葡聚糖凝胶的选用原则。 3掌握蛋白质分离的一般操作方法。 4进一步了解包括离子交换柱层析、亲和层析及吸附层析等其它分离纯化的方法。 试剂和器材： 1 试剂： 1.1 牛血清白蛋白（67000Da）-氯化钴溶液：牛血清白蛋白浓度3-5 mg/mL（4 mg/mL），氯化钴浓度40mg/mL，样品在10000r/min 离心5min。 1.2 葡聚糖凝胶Sephadex G-25、G-15 2 器材: 层析柱、恒流泵、自动部分收集器、紫外分光光度计等。 操作方法 凝胶溶胀（水化）?? 商品葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶均为干燥颗粒，使用前必须水化溶胀。商品琼脂糖凝胶呈悬浮胶体可直接用，玻璃球不用溶胀。  凝胶溶胀有两种方法：一种是将所需葡聚糖凝胶浸入蒸馏水中，于室温下溶胀；另一种是置于沸水浴中溶胀。各种葡聚糖在上述溶胀方法中所需的时间见下表： 表1 SephadexG-25的性质 型号颗粒直径大小（μm）吸水量 （g水/g干胶）溶胀度 (mL/ｇ干胶)浸泡时间（常温）浸泡时间（沸水浴）分级范围 （肽及球型蛋白质）最大操作压（cm H2O）G-2520-80 100-300 2.5±0.256h2h 2h 1000-50001002.5±0.256h1000-5000100凝胶溶胀后，需用蒸馏水洗涤几次，每次应将沉降缓慢的细小颗粒随水倾倒出去，以免在装柱后产生阻塞现象，降低流速。洗后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。  一支层析柱中应该装入的干胶量可以用下法推算：称取1g所需型号的葡聚糖干胶，放在5mL量筒中，用室