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实验专题模块四 DNA的提取及特定DNA片段的鉴定;在生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘与疾病研究的中心课题 生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起 DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象 DNA的提取是分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作，往往是分子生物学实验的第一步。它是基因克隆、分子标记、杂交检测等多种实验的基础。DNA质量的好坏，甚至直接关系到后续实验的成败。;分离纯化DNA的一般原则： ①应保证DNA一级结构的完整性，完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的最基本要求； ②排除蛋白质、脂类、糖类等其它分子的污染，纯化的DNA样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂或过高浓度的金属离子，蛋白质、脂类、多糖分子的污染应降低到最低程度； ③无RNA的污染。 因此，DNA提取的主要步骤，无外乎破碎细胞，去除与DNA结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除RNA，沉淀核酸以去除盐、有机溶剂等杂质，最后得到纯化的DNA。;注意与要求： ①减少化学因素对DNA的降解：避免过碱、过酸对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH4~10条件下进行； ②减少物理因素对DNA的降解：强烈振荡、搅拌，细胞突置于低渗液中，细胞裂解，反复冻贮等造成的机械剪切力以及高温煮沸等条件都能明显破坏大分子量的线性DNA分子，对于分子量小的环状质粒DNA分子，威胁相对小一些； ③防止DNA的生物降解：细胞内、外各种核酸酶作用于磷酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构；DNA酶需Mg2+、Ca2+等二价金属离子的激活，因此实验中常利用金属二价离子螯合剂EDTA，柠檬酸盐等，可基本抑制DNA酶的活性。进行DNA分离时最好新鲜生物组织或细胞样品，若不能马上进行提取，应将材料贮存于液氮中或-70℃冰箱中。;实验一 质粒以及质粒DNA的提取 一、实验目的 1. 掌握质粒的基本知识及其在生命科学研究中的应用。 2. 掌握碱裂解法提取质粒的原理与操作。;二、背景与原理 （一）质粒与质粒载体 质粒为染色体外的遗传单位，大小在1kb~200kb之间，结构简单，大多是具有双链闭合环状结构的DNA分子，通常以超螺旋状态存在于许多细菌和酵母菌中。 质粒具有不相容性，两种不同的质粒不能共存在同一个宿主细胞中。 质粒有筛选标记，能提示质粒是否进入宿主细胞，可明显地区别于其它细胞，筛选标记可为抗生素抗性基因或营养缺陷型基因，这样能改变宿主细胞的耐药性，使宿主细胞在含抗菌素环境中生存，或宿主细胞在缺乏某种营养组分时候还能生存。 质粒含有启动子序列，能够自我复制。不过质粒的复制和转录都依赖于宿主编码的蛋白和酶，或能在胞质中进行自我复制，或整合到细胞染色体中作为细胞遗传物质的一部分随染色体一起复制。 质粒的特点使其成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。;在生命科学研究中，把目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体（Vector）。 按组成元件的来源不同分为质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。 质粒是重组DNA 技术中常用的载体。质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。其自我复制能力及所携带的遗传信息在重组DNA操作，如扩增、筛选过程中都是极为有用的。;载体按其行使的功能，分为克隆载体和表达载体。 克隆载体主要用于扩增或保存DNA 片段，是最简单的载体。如pUC18和pUC19，载体，其结构组成紧凑，几乎不含多余的DNA片段。这些质粒缺乏控制拷贝数的基因，因此其拷贝数达500-700。pUC系列载体含有一段lacZ蛋白氨基末端的部分编码序列，在特定的受体细胞中可表现α-互补作用。因此在多克隆位点中插入了外源片段后，可通过α-互补作用形成的蓝白斑筛选重组质粒（图2-2）。;;表达载体是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体（图2-3）。其基本骨架为来自pBR322和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。;图2-3 pKK223-3表达载体图谱;质粒由几个基本元件组成，如启动子区，多克隆位点（MCS）和抗性基因等。 以毕赤酵母表达系统中使用的表达载体为例，主要结构有5