第十章沉淀分离技术.ppt

第十章 沉淀分离技术;盐析 有机溶剂沉析 等电点沉析 有机聚合物沉析 其他沉析技术 ; 一、盐析 原理 溶液加入高浓度中性盐后，盐离子与生物分子表面的带相反电荷的离子基团结合，中和了生物分子表面的电荷，降低了生物分子与水分子之间的相互作用，生物分子表面水化膜逐渐被破坏，当盐浓度达到一定的限度时，生物分子之间的排斥力降到很小，此时生物分子很容易相互聚集，在溶液中的溶解度降得很低，从而形成沉淀从溶液中析出。 产生盐析的另一个原因是大量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度，使生物分子脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀析出。 ;影响盐析的因素 （一）盐离子浓度 在低盐浓度时，盐离子能增加生物分子表面电荷，使生物分子水合作用增强，具有促进溶解的作用，称盐溶现象。当盐浓度达一定值后,盐浓度升高，生物分子溶解度不断降低,产生了盐析作用,不同的生物分子，“盐溶”与“盐析”的分界值不同。 ;;（四） pH值 在盐析时，如果要沉析某一成分，应将溶液的pH值调整到该成分的等电点，如果希望某一成分保留在溶液中不析出，则应使溶液的pH值偏离该成分的等电点。 （五）温度 多数物质的溶解度会受温度变化的影响。 ;盐析的操作与应用 （一）盐析的操作 1、盐的处理 硫酸铵使用时要求纯度较高，生产时为降低成本，一般选用化学纯的硫酸铵，在使用前应进行预处理，可通过化学法将重金属除去（如通入H2S后过滤），再将硫酸铵重结晶备用。 2、加盐的方法 （1）直接加入固体硫酸铵法 （2）加入饱和硫酸铵溶液法 ;3、盐析操作注意事项 （1）盐析反应完全需要一定时间，一般硫酸铵全部加完后，应放置30min以上才可进行固-液分离。 （2）经过一次分级得到的盐析沉淀，能否进行第二次盐析要靠试验确定。 （3）盐析操作时加入盐的纯度、加量、加入方法、搅拌的速度、温度及pH等参数应严格控制。 ;（4）盐析时生物分子浓度要合适，应充分考虑共沉及稀释后收率、盐量和固-液分离等问题。一般低浓度硫酸铵可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法，因为高浓度硫酸铵密度太大，要使蛋白质完全沉降下来需要较高的离心速率和较长的离心时间。（5）盐析后溶液应进行脱盐，常用的办法有透析、凝胶过滤及超滤等。;;二、有机溶剂沉析 原理 （一）亲水性有机溶剂本身的水合作用降低了自由水的浓度，使溶质分子周围的水化层变薄，导致脱水而相互聚集析出，也就是降低了溶质的溶解度。 （二）有机溶剂的介电常数比水小，加入有机溶剂后，整个溶液的介电常数降低，带电的溶质分子之间库仑引力增强，使溶质分子相互吸引而聚集。;影响有机溶剂沉析的因素 （一）温度 大多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此有机溶剂必须预先冷至较低温度，一般在0℃以下，操作时要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂必须缓慢，并不断搅拌以免局部浓度过浓。温度越低，得到的生物活性物质越多，而且可以减少有机溶剂的挥发。;（二）生物样品的浓度 与盐析相似，样品浓度低时增加有机溶剂投入量和损耗，降低了溶质回收率，易产生稀释变性，但共沉的作用小，有利于提高分离效果。反之，对于高浓度的生物样品，节省了有机溶剂，减少了变性的危险，但共沉作用大，分离效果下降。一般认为，对于蛋白质溶液0.5%～2%起始浓度较合适,对于粘多糖以1%～2%为起始浓度为宜。;（三）pH 有机溶剂沉析时适宜的pH，要选择在样品稳定的pH范围内，而且尽可能选择样品溶解度最低的pH，通常是选在等电点附近，以提高该沉析的分辨能力。但应注意的是有少数生物分子在等电点附近不稳定，影响其活性；同时尽量避免目的物与杂质带相反电荷而加剧共沉现象的发生。;（四）离子强度 在有机溶剂和水的混合液中，当离子强度很小，物质不能沉析时，补加少量电解质即可解决。盐的浓度太大(0.1～0.2mol／L以上)，就需大量的有机溶剂来沉析，并可能使部分盐在加入有机溶剂后析出。同时盐的离子强度达一定程度时，还会增加蛋白质或酶在有机溶剂中的溶解度。所以一般离子强度在0.05或稍低为好，既能使沉析迅速形成，又能对蛋白质或酶起一定的保护作用，防止变性。;（五）金属离子 在用有机溶剂沉析生物高分子时还应注意到某些金属离子的助沉作用，一些金属离子如Zn2+、Ca2+等可与某些呈阴离子状态的生物高分子形成复合物。这种复合物的溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉析形成，并降低有机溶剂的耗量，0.005～0.02mol／L的Zn2+可使有机溶剂用量减少l／3至1／2,使用时要避免会与这些金属离子形成难溶盐的阴离子(如磷酸根)的存在。 ;有机溶剂沉析的应用 （一）有机溶剂沉析的特点 优点：分