分子克隆技术--精品课程资料.ppt

分子克隆技术;实验简介;分子克隆技术：利用质粒载体克隆外源DNA片段，通过这个实验大家可以掌握质粒载体的抽提、外源DNA的准备、酶切、连接及感受态细胞的制备、连接产物的转化以及阳性克隆子的鉴定和验证等 分子杂交技术：主要通过做Southern杂交，掌握植物总DNA的抽提、质量检测、限制性内切酶操作、DNA的琼脂糖凝胶电泳、Southern 转移、探针的制备、同位素操作等方面的操作技术 表达分析: 通过做RT-PCR掌握RNA的抽提，质量检测及RT-PCR的操作;实验注意事项;用质粒载体克隆水稻DNA片段;;实验内容;是一个复制子： 载体在受体细胞中能大量繁殖，其携带的外源基因才能在受体细胞中得到大量扩增 有1到多个限制内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入 具有选择性的遗传标记(如抗生素抗性标记等)以此知道它是否已进入受体细胞，并据此标记将受体细胞从其他细胞中分离出来;Plasmid Cosmid, Fosmid P1 YAC (Yeast Artificial Chromosome) BAC (Bacterial Artificial Chromosome) MAC (Mammalian Artificial Chromosome) PAC (P1-derived Artificial Chromosome) BIBAC (Binary-BAC) TAC (Transformation-competent Artificial Chromosome);实验一 质粒的制备 ;质粒是染色体之外的一种稳定的遗传因子，大小在1－20kb之间，是双链闭合环状DNA分子，具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数可表达它所携带的遗传信息。它可独立游离于细胞质中，也可整合到细菌染色体上。质粒在细胞内的复制可分为严谨型（只在细胞周期的一定阶段进行复制，一个细胞内只有1至几个拷贝）和松弛型（细胞周期中随时可以复制，拷贝数较多，一般在细胞内有20个以上）;Multiple cloning site;从平板上挑取单菌落接种于含相应抗生素的培养基中，培养至对数生长后期即可(松驰型质粒)。严谨型质粒（拷贝数较低）可采用氯霉素扩增的办法来扩增质粒; 通过离心收集菌体；细菌的裂解可采用离子型或非离子型去污剂、有机溶剂、碱处理或加热处理等方法。（具体采用何种方法取决于质粒的大小、大肠杆菌菌株及裂解后纯化质粒的方法）; solution I重悬细菌后，加入solution II，其中的SDS破坏细胞壁、膜，使细胞内容物释放出来，NaOH 使DNA变性、碱基对打开，使宿主染色体DNA双链分开，而闭合环状的质粒DNA处于拓扑缠绕状态，两个环并不分开，当加入Solution III 中和后宿主DNA由于很大，碱基还未来得及配对就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起沉淀下来，而质粒DNA由于很小且双链未分开，能够迅速配对重新形成超螺旋，处于溶解状态。;质粒的沉淀：加2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟或两倍体积95％乙醇混匀，冰上放置10分钟； 质粒的纯化：一般采用苯酚/氯仿纯化质粒; 为满足较高要求，可采用氯化铯密度梯度离心;实验步骤;加入300?l 溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀； 12000 g离心10分钟； 吸取800?l 上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟； 12000 g 常温离心15分钟； 倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐，（放置片刻后倒去上清；或离心5分钟） 加40?l 灭菌超纯水或TE溶解； 质粒的质量检测，于-20℃保存。 ;Solution I: Tris.HCl （pH 7.5） 50 mM EDTA 10 mM RNase 100 μg/ml Solution II: NaOH 0.2 M SDS 1 % Solution III: Final concentration KAc 1.32 M Using HAc to adjust pH to 4.8 TE (pH 8.0) Tris.HCl （pH 8.0） 10 mM EDTA （pH 8.0） 1 mM ;氨苄青霉素（ampicillin）： 能够杀死正在生长的大肠杆菌，其主要通过抑制肽聚糖交联而抑制细胞壁的合成。 氨苄青霉素抗性基因（ampr）：合成β-内酰胺酶，在氨苄青霉素进入细胞之前将其水解。 RNaseA: C或U的3’－P与相邻的5’－O