北京大学医学部-实验动物学-基因打靶2012资料.ppt

基因打靶 （Gene targeting） 郭长占 北京大学医学部 E-mail: guo4626@. ; 技术先进性 实现转基因定点整合; (一)基因打靶的原理 基因打靶(gene targeting)是根据DNA同源重组的原理而设计的一项技术。在这一技术中，体内细胞基因组的某一段DNA序列被视为“靶子”，经精巧构建的欲导入的外源基因DNA序列被视为“弹头”，这样导入的外源基因进入受体细胞后就不再是随机整合而是“弹头”锚准“靶子”进行准确的定点整合。 ; 打靶载体(targeting vector)。; 基因打靶的结局有如下可能： (1)基因击入(gene knock-in) 在受体细胞基因组中定点引入一个完全新的基因。 (2)基因敲除(gene knock-out) 受体细胞内源靶基因被灭活,。 (3)基因替代(gene replacement) 靶基因被导入的外源基因替代，可以是以正常基因替代突变的内源基因。;(二)基因打靶的方法： 进行基因打靶要经历以下步骤： （1）构建打靶载体。 （2）打靶载体导入受体细胞(常用胚胎干细胞(embryonic stem cell，即ES细胞)。 （3）打靶ES细胞导入囊胚。 （4）囊胚植入假孕母鼠子宫发育。 ; 1. 打靶载体的构建： 基因打靶的关键在于构建打靶载体。在打靶载体中需要一个与靶基因同源的DNA片段，这一片段称为同源重组指导序(homologous recombination directing sequences, HRDS)。外源基因插入这一同源序列之中。长度可从3kb至15kb。; 通过同源重组将外源基因导入固定位点,从而有目的的突变内源基因，图中单线表示内含子，框图表示外显子 ; 2. 外源基因导入靶细胞： 基因打靶所使用的受体细胞一般用胚胎干细胞(ES细胞)，ES细胞是一种多潜能的干细胞，能在体外传代而不改变其多潜能性。小鼠胚胎干细胞是从着床前胚胎(孕3 － 5天)内细胞群分离的细胞。 1981年由英国剑桥大学的Evans和Kaufman首先分离培养成功。 ;英国卡迪夫大学(Cardiff University)卡迪夫生命科学学院Martin J. Evans; 外源基因导入ES细胞的方法有: 1.电穿孔法 2.逆转录病毒载体法 3.脂质体包装法 4.磷酸钙沉淀法 ; 外源基因导入ES细胞与否，还需经过G418和GANC培养基筛选。由于同源重组的频率很低，因而筛选并富集真正发生了同源重组的细胞是至关重要的。筛选可采用正负选择法。实现基因打靶的ES细胞能抵抗G418 而不能利用GANC。 G418 GANC ;正负选择法的原理;同源重组（基因打靶 Gene Targeting）;随机整合(Random Integration）;; 打靶ES细胞的鉴定与扩增 筛选出G418R/GANCR的细胞克隆后再用PCR方法进一步鉴定，鉴定后的ES细胞克隆在体外培养扩增。;ES细胞注入囊胚与囊胚植入;; 3.基因打靶小鼠的繁育(breeding) 用基因打靶的方法产生的第一代子鼠为嵌合体(chimera)小鼠，即小鼠由囊胚的细胞及经基因打靶的ES细胞共同发育而来。因此并非小鼠的全部细胞中都整合有导入的外源基因，能否繁育与遗传需要鉴定。; 为获得真正的转基因小鼠，还需要用打靶后出生的雄性小鼠与提供囊胚的正常雌鼠交配，即回交(back–cross)。如果回交后出生的子代鼠中有野生型的小鼠(+/+),即完全不携带有外源基因。也有转基因杂合子的小鼠(-/+)。则证明该小鼠可以将外源基因遗传给后代，该小鼠为转基因小鼠。 再用杂合子小鼠互交（intercross），从出生的子代鼠中可鉴定、筛选出纯合子的基因打靶小鼠。再经繁育可建立转基因小鼠品系。; 实验流程 ; (三) 组织特异性基因打靶 应用ES细胞和同源重组原理而发展起来的基因打靶技术使转基因动物的研究又向前迈进了一步，但仍有其局限性。主要问题是虽然通过基因打靶实现了外源基因在受体细