细胞凋亡的流式检测应用.pptVIP

细胞凋亡的流式检测应用;1. 细胞凋亡的基础知识 2. 流式细胞术检测细胞凋亡的研究方法 3. 细胞凋亡检测面临的问题 ;1. 细胞凋亡的基础知识：;与细胞凋亡有关的疾病;细胞凋亡的形态特征; 是细胞受到严重损伤或大剂量细胞毒药物作用后 出现的反应。 早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀。 继而溶酶体破裂,细胞内容物流出, 引起炎症。;细胞凋亡与细胞坏死的区别;细胞凋亡与坏死的区别;2.流式细胞术检测细胞凋亡的研究方法; 2.1 PI单染检测 2.2 Annexin V/PI(7-AAD)双染检测 2.3 细胞内钙离子测定 2.4 线粒体膜电位检测 2.5 Caspases细胞酶的检测 2.6 DNA 碎片分析：Apo-BrdU 2.7 凋亡相关蛋白：Fas、Bcl-2、P53 ;与细胞周期相同，利用PI染色，通过检测DNA含量来同时判定细胞周期和凋亡。 凋亡过程中，细胞内核酸酶释放，细胞DNA发生有序降解，被降解的低分子量DNA片段从变性细胞膜（经乙醇及透膜剂处理）漏出细胞外，使得凋亡细胞内的DNA含量减低，在流式细胞仪测定细胞DNA含量直方图中G0/G1峰前可出现亚二倍体峰，即凋亡峰 通过峰下的面积值可得出凋亡细胞在所测细胞群中所占的比率。 ; PI单染色法的最大优点在于获得凋亡细胞百分数的 同时可以与细胞周期中其他时相的细胞进行比较 该法简便、标本制备容易、检测费用低 缺点：PI单染色法无法确认来自哪一时相的凋亡，对于S 期和G2/M 期的细胞发生凋亡时，凋亡峰有时与G1 峰或S 峰相互重叠，导致G1 峰或S 峰增宽而无典型的sub-G1 峰出现，所以无法分析来自S 期或G2/M 期细胞的凋亡，应借助其他方法进行检测;注意事项 单细胞悬液的细胞数要充足，过少的细胞数会影响PI直方图上各时相的变异系数(CV)。当G0/G1 期的CV10% 时，结果的可信度下降。 终浓度为70% 的乙醇固定效果最好，而甲醛或多聚甲醛均会影响亚二倍体峰的出现。 4C 或-20C 固定较37C 固定效果好。 固定后PBS悬浮时间为5~10min ，不宜过长，否则容易与细胞碎片混淆 固定过程中充分混匀细胞，减少细胞粘连成团。;磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）异位：正常情况下，PS位于细胞膜内层，细胞发生凋亡时PS从细胞膜内翻转并暴露在细胞膜外层，是细胞发生凋亡的早期事件。 ;Annexin V选择性结合PS 。用带有荧光标记的Annexin V，就可以用流式细胞仪非常简单而直接地检测到磷酯酰丝氨酸的外翻这一细胞凋亡的重要特征。 PI(7-AAD)可以染色坏死细胞或凋亡晚期丧失细胞膜完整性的细胞，呈现红色荧光。对于坏死细胞，由于细胞膜的完整性已经丧失， Annexin V可以进入到细胞浆内，与位于细胞膜内侧的磷酯酰丝氨酸结合，从而也使坏死细胞呈现绿色荧光。 ;检测方法： 收集细胞并重悬于Binding Buffer(结合液)中 加荧光标记的Annexin V和PI 室温、避光孵育5分钟 流式细胞仪检测结果;注意事项 细胞制备(如贴壁细胞)或储存时细胞膜的破损会导致PS跨膜分布的改变，造成假阳性； 巨噬细胞或其他细胞吞饮凋亡小体时，Annexin V检测也会阳性。 ; Annexin V细胞膜磷脂酰丝氨酸检测： Annexin V/PI凋亡检测试剂盒及相关试剂 Annexin V/7-AAD凋亡检测试剂盒及相关试剂 此法简单、可靠，由于凋亡时细胞膜的改变大大早于DNA 的改变，因此Annexin V/PI(或7- AAD )双染色是检测早期凋亡细胞的敏感方法。 由于该法必须用活细胞，因此检测时间受到限制，且对凋亡晚期细胞和坏死细胞无法准确区分。 ; Fluo-3-Am为新型的高度特异性Ca2+荧光指示剂，进入细胞后经非特异性酯酶脱去Am酯，成为脂溶Fluo-3留在细胞内，当Fluo-3与胞内游离钙结合后，其荧光强度是Fluo-3本身的40倍以上，当用480nm波长激发时，其荧光强度与游离钙离子浓度成正比。 Fluo-4 将Fluo-3结构中的Cl替换成F ， 荧光强度比Fluo-3强1倍 Fluo-4与钙离子的亲和力和Fluo-3近似，使用上和Fluo-3也基本相同，可以使用流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化。 Fluo-4-AM是Fluo-4的乙酰甲酯衍生物，通过培养，能够轻易进入细胞中。AM进入细胞后会被胞内酯酶所水解，产生的Fluo-4随后会和钙离子结合并发出荧光。