青霉素酰化酶.pptxVIP

β-内酰胺类抗生素的发展现状 近年来，全球抗生素的市场份额约为250—260亿美元，其销售额占世界药品销售额的15％左右并保持8％左右的年增长率。据调查资料显示，世界各地抗感染药市场所占的比例大体是：美洲为31％，亚洲为31％，欧洲为27％，非洲和大洋洲约占11％。从美国抗感染药的销售情况看，头孢菌素类独占鳌头，占45％；其次是青霉素类占15％；第三是喹诺酮类占12％；大环内酯类为第四，占6％；四环索类为第五，占5％；其它类占17％。在中国医药市场中，抗感染药物已经连续多年位居销售额第一位，年销售额为200多亿元人民币，占全国药品销售额的30％，在我国，抗生素是临床应用最为广泛的一类药物，市场规模约600亿元，年平均增长率达到了24％。中国抗生素人均年消费量在138g左右，这一数字是美国的10倍。2010年，抗生素原料药和制剂企业增长强劲，在医保方面的推动下，化学普药市场快速增长。;PA最早从Penicillium chrysogenum Q176分离得到。现已在多种微生物体内发现有该酶存在，如各种细菌、放线菌、真菌、酵母等。青霉素酰化酶是一种酰胺键水解酶，其系统名是青霉素氨基水解酶(E.C.3.5.1.11) ，但习惯名如青霉素酰化酶、青霉素氨基／酰基转移酶继续被沿用。根据底物优先性，可以将其分为3类 1. 青霉素G酰化酶（PGA），主要由细菌产生，属于球蛋白，分子量较大，等电点为 6.5~6.7，分子大小为70à×50à×50à，大多数属于胞内酶，是一种酰胺键水解酶，优先水解青霉素G生成6-氨基青霉烷酸(6-aminopenicillanic acid，简称6-APA) 和苯乙酸（PAA），对底物专一性不太严格，属非专一性催化酶； 2. 青霉素 V 酰化酶（PVA），主要存在于霉菌、放线菌及酵母菌中，对底物专一性很高，仅水解青霉素 V，都属于胞外酶； 3. 苄基青霉素酰化酶（APCA），主要存在于黑色假单孢杆菌和卵形假单孢杆菌中，专一性地水解氨苄基青霉素。 ;β-内酰胺类抗生素 青霉素类和头孢菌素类化合物都含有β-内酰胺结构， 是β-内酰胺类抗生素中的两类重要成员。它们主要通过共价键与青霉素结合蛋白结合来抑制细菌细胞壁粘肽的合成，是临床应用最为广泛的一类抗感染的药物。由于细菌耐药性的发展，原有的青霉素和头孢菌素已经不能满足有效治疗感染，通过将青霉素的母核6-氨基青霉烷酸(6-APA)，头孢菌素C的母核7-氨基-头孢霉烯酸(7-ACA)以及头孢菌素G的母核7-氨基脱乙酰氧头孢烷酸（7-ADCA)进行修饰，接上不同的侧链而获得多种广谱抗菌的治疗药物，统称半合抗工业。其中氨苄西林，阿莫西林，头孢克洛，头孢立新，头孢羟氨苄和头孢唑林等占据了世界抗生素销售量的65％，在2000年产量已经超过了45000吨。目前，工业上生产这类药物大多采用半化学合成法，通常采用酰氯法或者混酐法，需要-30℃的低温，大量的有机氯溶剂以及产生大量的工业三废，如从头孢菌素出发生产1kg的头孢立新将产生约30～40kg的不能利用的三废，对环境造成了极大的污染。相对化学法而言，酶法合成具有绝对专一性、避免造成环境污染、反应条件温和等优点，并且生产成本至少可以降低9％ 。若酶法合成6-APA与发酵生产青霉素结合，整个生产过程就更经济。;Unit cell(单位晶格) a=50.93 ?, b=63.97 ?, c=64.19 ? alpha=72.85, beta=73.77, gamma=74.06;应用领域及概况;酶活测定方法;荧光胺测定法 标准曲线的制作及斜率的计算：把6-APA纯品用pH 4.0,0.2M的NaAC-HAC缓冲液配成从1μg/ml、10μg/ml的系列溶液。各取0.5ml分别放在试管中,依次加入0.5ml荧光胺溶液, 搅匀后,再加入pH4.0的NaAC-HAC缓冲液2ml。静置1h,读荧光值(激发波长401.5nm,发射波长475nm)。以pH4.0的NaAC-HAC缓冲液代替6-APA溶液作对照。由标准曲线所得的各组数据,用最小二乘法求出标准曲线的,斜率。 酶活的测定：取2只试管分别加入0.5mL酶液和3.5mL青霉素G钠溶液，于37℃保温10分钟后混合，再保温t分钟。吸取酶促反应液0.5mL，迅速加入0.5mL荧光胺溶液，混合后再加入2mL，pH 4.0，0.2M的NaAC-HAC缓冲液，静置1h，测荧光值，对照管是以3.5mL，0.05M PB, pH 7.8代替青霉素G钠溶液 酶活（U/mL）=(（样品荧光值?对照荧光值）×??^，)/(??×??×??) 其中p:曲线的斜率；V样品体积（mL）；t:酶促反应时间（min）；V,:酶促反应总体积。 酶活