新质粒DNA的小量制备与纯化资料.pptVIP

实验十二 质粒DNA的 小量制备与纯化;一、实验性质：操作性;三、原理; 质粒是基因工程中最常用的载体，作为载体的质粒必须具备以下 六个特点： ; 本次实验是从大肠杆菌中提取和纯化质粒，以备进一步研究之用。 从大杆肠菌中提取和纯化质粒的方法很多，但不外乎三个步骤,即 细菌的培养 细菌的收集和裂解 质粒的分离和纯化 原理如下：;1 细菌的培养;;;;2 细菌和收集和裂解;裂解细菌的方法：SDS法、碱裂解法、煮沸法;本实验采用碱裂解法:;3 质粒的分离和纯化;;5 操作步骤;;;;5.5 加入 200ul 溶液Ⅱ，轻轻颠倒混匀 5 次，置冰浴5分钟。 作用: SDS--去污剂，使细胞裂解； NaOH--变性剂，使蛋白质、核酸变性 注意：溶液II 必需在临用时新鲜配制 此时溶液???胶胨状，严格控制混匀 次数和变性时间。 ;5.6 加入150ul 溶液Ⅲ，颠倒混匀7次，置 冰浴10分钟。此时，可见大量白色沉淀。 溶液Ⅲ：醋酸钾（KAc）缓冲液（ KAc 和冰醋 酸），pH 4.8。 作用：酸液，中和NaOH，使质粒DNA、 小分子RNA复性（可溶），染色体 DNA、高分子量RNA、K+/SDS/蛋 白质/膜复合物不能复性而沉淀。 注意：此时溶液出现大量絮状沉淀。;;;5.9 15,000rpm离心10分钟，弃上清，控干 5.10 50ul TE (Tris-HCl 和 EDTA )溶解沉淀( 吹 打一定要充分) ，加入50ul 冰预冷的5M LiCl，混匀，置冰浴10分钟。 作用：使大分子rRNA、mRNA沉淀，而 DNA不沉淀。;;5.13 2倍体积(200ul) -20℃预冷的无水乙 醇，混匀，置-20℃沉淀10分钟 。 5.14 15,000rpm 离心 10 分钟，弃上清。 5.15 待乙醇挥发干净后，将沉淀溶于20ul TE，电泳分析或置于-20℃保存。 ;6 结果分析;7 注意事项：;;;8 思考题;