新质粒DNA的提取资料.ppt

分子生物学实验Experiments of molecular biology ;一、 教学目的;二、 教学要求 通过学习使学生对所有实验内容有一个整体的了解； 熟悉分子生物学实验技术（包括DNA技术、RNA技术、蛋白质技术、杂交技术等）的基本原理方法，掌握DNA提取纯化,定量, DNA克隆, 电泳等基本实验技术，重点掌握质粒DNA纯化技术, 酶切技术, DNA片段回收,重组连接技术, 电泳技术, 转化技术, 基本PCR技术以及蛋白质的诱导表达技术等； 要求学生分子生物学实验实验室操作安全与污染物处理； 学习仪器设备的使用 ;分子生物学实验室要求;实验一核酸的提取（质粒DNA的提取和纯化）;【实验背景】;提纯的思路;【实验原理】;在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。 当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，。 大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。 ; 【仪器 】 恒温摇床、 台式高速离心机、 高压灭菌锅、 微量取液器(20μl,200μl,1000μl) ;试剂;各试剂的作用： 溶液I 　　作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 溶液II 　　作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。 溶液III 　　作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉淀，K＋可中和DNA ;酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）： 　 作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫） 注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。 无水乙醇： 除去DNA水化层，使DNA沉淀 TE缓冲液： 溶解DNA;三．实验方法;７．加入等体积酚/氯仿（１：１），振荡混??，12000g 4 ℃离心5分钟。取上清移至另１个Eppendorf管中。 ８．加入２倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置15分钟。 ９． １２０００g ,4 ℃离心10分钟。 １０．弃上清，加入１ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次，１２000g 于4 ℃离心10分钟。 １１．弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。 １２．加入50μl TE（含20μg/ml RNA 酶）溶解DNA。 -20℃保存