第七章核酸提取与鉴定研究资料.pptVIP

;1;研究对象：基因组DNA、质粒DNA、总RNA、mRNA;1、植物样品 新鲜组织先用无菌生理盐水洗； 干药材除去霉点，无菌水浸洗；;2、动物样品;（2）血细胞样品：;3、微生物培养物样品 离心获取菌体细胞， 加缓冲液洗涤， 加缓冲液悬浮菌体细胞。;（二）提取用具预处理;二、真核生物基因组DNA的常规提取; ⒈ 破碎细胞，溶解DNA： 用提取液（裂解液）破坏细胞壁、细胞膜和核膜。 微生物样品提取液：含表面活性剂SDS、溶菌酶等 动物样品提取液：含SDS、蛋白酶K等 植物样品提取液：含CTAB 核酸酶可被Ca2+、Mg2+等激活，提取液均含有螯合剂（如EDTA，柠檬酸等），螯合这些离子。;2、除去杂质（主要是蛋白质） ;3.沉淀DNA 有机溶剂沉淀DNA：2倍体积无水乙醇（或1倍体积的异戊醇） 再用75%乙醇清洗多次。 4.重新溶解DNA 将DNA溶于水或TE溶液。;　CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）; SDS法原理;DNA提取的一般流程;三、质粒DNA的提取;1、培养细菌和扩增质粒;2、收获细菌和溶菌;3、分离质粒DNA;通过加热，使细菌裂解、蛋白质和DNA变性。 降低温度，质粒DNA复性留于上清液，基因组DNA复性很慢与蛋白质形成沉淀，可通过离心除去。;离心分离后，吸取含有质粒DNA的上清液。 用苯酚、氯仿抽提，除去溶解于上清液中的蛋白质。 用乙醇或异戊醇沉淀质粒DNA（与基因组DNA方法同）。;四、RNA的提取;常用的RNA酶抑制剂 ;（1）提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备;所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。 严格来说，所有溶液均应用0.1％DEPC于37℃处理12小时以上，然后于100℃加热15分钟或高压灭菌15分钟，去除残余DEPC。; 在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩，应勤换手套。 ;;RNA的提取方法 ;2、盐酸胍-有机溶剂法;4、一步快速热酚抽提法;5、试剂盒快速提取法;Trizol一步提取总RNA：;1）实验前取冰，4℃离心机预冷，DEPC处理水（高压灭菌处理）配制的75%乙醇4℃预冷；;8）室温，静置10分钟（该条件由Trizol试剂盒提供；其他提供的条件用-20℃、1小时，目的为了更好分层）;组织匀浆 ; （二???mRNA的提取;（一）核酸浓度检测 ;（二）核酸纯度检测（紫外吸收法）;（三）核酸完整性检测;根据电泳支持介质分为;琼脂糖凝胶电泳;琼脂糖凝胶电泳装置 ;;RNA可以使用非变性或变性凝胶电泳进行检测。 在非变性电泳中，可以分离混合物中不同分子量的RNA分子，但是无法确定分子量。 ;RNA变性电泳： RNA为单链分子，局部形成发卡结构，直接电泳无法确定分子量。 只有在变性情况下，RNA分子完全伸展，迁移率才与分子量成正比。 方法： 电泳前样品保温60℃， RNA分子伸展。 凝胶中加有甲醛，使RNA在电泳过程中保持单链结构。;操作流程大致为： 凝胶的制备→加样→电泳→染色→观察和拍照;上样缓冲液：;加样;常用的电泳缓冲液;DNA电泳（紫外灯） ; 基因组DNA抽提结果电泳图 ;总RNA抽提结果电泳图 ;聚丙烯酰胺凝胶电泳 ;聚丙烯酰胺凝胶制胶装置