第五章分子生物学研究法(上)2资料.ppt

分子生物学基本研究法（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术;扉页： 当你进入实验室时，要像脱去外衣那样放下你的想象力，因为实验操作中不能有一丁点儿的想象，否则，你对事物的观察就会受影响；当你翻开书本的时候，你又必须尽可能展开想象的“翅膀”，否则，你就不可能走在别人的前面。;RNA基本操作技术 真核生物基因组DNA庞大，有大量重复序列，很难直接分离得到靶基因片段。而cDNA来自反转录的mRNA，无冗余序列，通过筛选cDNA文库，可较快地分离到相关基因。;5.3 RNA基本操作技术;5.3.1 总RNA的提取;Trizol总RNA提取试剂 ;RNA的抽提方法;RNA Extraction by TRIzol;使用BioSpcetrometer分光光度计进行快速检测核酸;mRNA Extraction from Cell Culture;mRNA Extraction from Tissue;2. 硅胶膜纯化柱法 将含有目的RNA的细胞破碎液通过该柱，RNA吸附在硅胶膜上，然后在低盐浓度下可从硅胶上直接洗脱RNA。;RNA的浓度和纯度的判断： 可通过测定其OD260和OD280 OD260＝1时，相当于浓度为40μg/mL，当OD260/OD280＝1.8～2.0时，说明RNA纯度较好。;5.32. mRNA的纯化;;Promega PolyAT tract mRNA 分离系统分离多聚(A)mRNA。将用生物素标记的寡聚(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的抗生物素蛋白，用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA。;图5-14 PolyATtract mRNA的分离纯化过程简图。;每个Oligotex Kit 包括用于结合poly A+ mRNA的Oligotex 树脂，和用于洗涤、洗脱结合的mRNA的离心柱。Oligotex mRNA Kits可从总RNA中纯化mRNA，回收poly A+体外转录子。Oligotex Direct mRNA Kits 可从细胞和组织中纯化mRNA。;5.3.3 cDNA的合成;图5-15 cDNA合成过程示意图。 第一链cDNA的合成：以mRNA为模板，反转录成cDNA，由反转录酶催化，需引物（常用oligo dT）。 第二链cDNA的合成：以第一链为模板，由DNA聚合酶催化。;图5-16 cDNA合 成中的分子修饰。;cDNA 的合成;5.3.4 cDNA文库的构建;构建cDNA文库的基本程序： ①mRNA的提取和纯化。 ②合成cDNA第一链。 ③将mRNA-cDNA杂交分子转变为双链cDNA分子。 ④将双链cDNA重组到噬菌体载体或质粒载体上。 ⑤将重组子体外包装成具有感染力的噬菌体颗粒导入到大肠杆菌寄主细胞中增殖。;构建基因???文库的基本程序：;构建基因组文库的基本程序：;构建基因组文库的基本程序：;基因文库的建立;基因组DNA文库;基因组文库与cDNA文库的差别;5.3.5 基因文库的筛选;5.3.5.1 核酸杂交法;5.3.5.2 PCR筛选法;5.3.5.3 免疫筛选法;5.4 SNP的理论与应用;5.4.1 SNP概述;;;5.4.2 SNP的检测技术;基因分型（genotyping）：是指利用数据库中已有的SNP进行特定人群的序列和发生频率的研究。 主要包括： 基因芯片技术、 Taqman技术、 分子信标技术 焦磷酸测序法等。;2.5.2.1 基因芯片技术;优点：高通量 一次可对多个SNP进行规模性筛选 被检起始材料少 操作步骤简单 缺点：芯片设计成本高 若样品复杂，有些SNP不能被检出;5.4.2.2 Taqman 技术;5.4.2.3 分子信标技术;Taqman和分子信标法 优点：可同时对多个SNP进行分析，操作简单，可自动化； 缺点：不能达到高通量分析，荧光探针费用高。;;5.4.2.4 焦磷酸测序法(Pyrosequencing );基本步骤;;;5.4.3 SNP的应用;Gene SNP