课件9-管式凝胶等电聚焦》.pptVIP

《管 式 凝 胶 等 电 聚 焦》;1、实验原理：;4、试剂与配制：;4-2、试剂的配制：;5、操作步骤：;5-1、凝胶系统的配制：;5-2、凝胶的聚合：（属光聚合法） 每组同学轮流排队加胶，不得各自分装以免浪费 （1）、将清洁、干燥的小玻管一端，用胶布贴封后，朝下 垂直放入有机玻璃凝胶玻管架的孔中，并在小玻管 的8.0 cm处作一记号。 （2）、用自动取液器（1000 ul）或注射器吸取上述配好 的凝胶溶液沿着小玻管内壁小心准确加入8.0 cm高。 （3）、凝胶加毕后，随即用注射器吸取蒸馏水，加至管中 的凝胶表面（1.0cm），使其表面覆盖一水层。 （4）、然后将凝胶管随支架一同移入日光灯箱内进行光聚 合约一小时。在聚合一开始，管中的界面渐至消 退，待胶体形成后，又将重新可辨（一般30分钟左 右即可），此时表明胶体已经凝聚。; 5-3、聚 焦： 5-3-1、凝胶管的安装： （1）、取出并选择合适的聚合完毕的凝胶管，然 后弃去 凝胶管底端胶布，并倒去管端内的溶液。 （2）、用滴管分别吸取的上电极槽溶液和下电极槽溶液 洗涤凝胶管的上端和下端的凝胶表面。 （3）、将凝胶管的上端统一插在上电极槽底板的各同心 橡皮圈孔中（注意密封） ; 5-4、加电极溶液： 先用滴管吸取上电极槽溶液，在每凝胶管上端逐一加满，然后在 上、下两极槽内分别加入各自的上、下电极槽溶液。其用量，上电 泳槽以电极完全浸入为宜，下电泳槽以凝胶管尽可能全浸入为宜。 提示： 在加入电极溶液时一定要避免或排除上、下玻管口内所留有的 气泡，另外上、下电极槽内的电极溶液不得加错。;5-5、电泳： 将上、下电泳槽对合好，上电极槽电极接电源 的正极，下电极槽电极接电源的负极，使起始电 压调约为200伏，10分钟后，将电压调至250伏特，并在 室温下恒压不变，在此条件下聚焦约2小时，即可。;5-6、取出玻管内的凝胶：（又称剥胶） 将一支带有长针头的注射器吸有适量水（蒸馏水或自来 水），把针头慢慢插入玻管内壁和凝胶柱表面之间，一 边开始压水，一边同时使针头慢慢贴紧管壁呈螺旋式前 进，如果一端不行，再在管的另一端按同样的方法剥 离，这样依靠水流的压力和滑润力，使玻管内壁与凝 胶分离，最后用洗耳球在管的一端轻轻挤压，另一端对 着一干净大小适宜的培养皿内，此时可以将凝胶柱压出 玻管。在凝胶挤压之前先在凝胶一端（阳极或阴极）插 入 一根细铜丝或硬尼龙丝，作一记号，以免将极端搞 错。 注意：剥凝胶时主要一点是不要损伤凝胶柱表面 。;5-7、凝胶的处理与pH曲线的测定： （1）、将取出的两条凝胶柱，取其中的一条凝胶柱置于 玻板上，自然摆直用直尺分别准确量取凝胶柱全 长的长度（mm/cm）[编为L3]。 （2）、量取后的置于玻板上的凝胶与直尺对应好，用刀 片以阳极为起始端，按0.5 cm 一段顺序切下， 切下后，将每一段顺序放入已编号的试管中。 （3）、再依次在试管中加入蒸馏水1.0 ml ，抽提2.0小 时（或过夜）。 （4）、取出抽提液，用pHS—2型酸度计从起始端（阳极） 依次测定每管的pH值，并记录所测定的数据（结 果见表X???。 （5）、然后以pH为纵坐标，凝胶长度（mm/cm）为横坐 标，制作出pH曲线图（结果见图X）。;;其校正的方法如下： L3 L1 = L2 － L4 L1 ：测试品各带的实际长度。 L2 ：样品带经固定后所测出的长度。 L3 ：供测pH曲线的参考凝胶柱全长。 L4 ：经固定染色后凝胶柱全长。 按效正公式计算出测试品各带实际长度（结果见表 X）。;6、实验结果： 6-1、未固定的凝胶柱分段（0.5cm / 段）测定pH结果：