生化技术：7 亲和层析.pptVIP

第 七 章 亲 和 层 析;物质分离纯化的依据;亲和层析的概念;第一节 基 本 原 理;一、基本原理;二、分 类;三、特 点;第 二 节 操 作;一、基质的选择;;二、配体的选择;1.与被纯化物质有适宜的亲和力;2.具有与基质共价结合的基团;三、亲和吸附剂的制备;1.活 化;边加边搅拌 反应液应始终保持pH11~12 反应会放热，要用水浴中加碎冰的方法控制温度在20℃维持8~10min后，再加入大量碎冰使反映体系快速冷却至4℃或更低温度 整个活化过程越快越好：因为活化的Sepharose在碱性条件下不稳定;2.偶 联;3.洗 涤;4.配体结合量的测定;（1）直接测定法;②根据配体的特性进行测定;（2）间接测定法;四、特异性吸附;五、分离大分子物质;竞争性洗脱剂 专一性强，并能洗脱出和配体特异性结合的大分子物质；但洗脱需要的洗脱液较多 剧烈的洗脱条件 如用盐酸胍、尿素等变性剂配制的溶液洗脱蛋白质等生命大??子物质时洗脱液须及时处理恢复有效成分的活性；如透析法等;六、亲和层析柱的再生;第三节 提高吸附剂的操作容量;影响吸附剂操作容量的因素;一、在配体和基质间引入“手臂”;2.吸附剂衍生物的制备;二、增加配体取代的程度;三、配体与基质以最小的键连接;四、基质多孔性的影响;五、其他;第 四 节 应 用 实 例;一、纯化大分子物质;2.糖蛋白 目前用于纯化糖蛋白的亲和配体主要是凝集素（lectin），即以lectin-Sepharose-4B为载体分离各种糖蛋白。 如 Con.A用于分离含甘露糖和葡萄糖苷的糖蛋白 云扁豆凝集素（lenlil）用于分离甲状腺球蛋白 反过来，用糖蛋白作为配体，也可用于分离纯化相应的凝集素;3.含巯基蛋白 用活化的-SH-Sepharose-4B（容量低）或巯基丙酰-Sepharose-6B（容量高）作吸附剂可用于分离含-SH的蛋白质、肽、酶和核苷酸等（洗脱剂用含L-Cys的缓冲液，即可洗脱被分离的巯基化合物）;4.核酸 ①用PolyU-Sepharose吸附剂可分离mRNA ②用PolyA-Sepharose吸附剂可分离束缚mRNA的蛋白质、束缚PolyA的RNA、依赖DNA的RNA-pol等;5.其他 直接利用基质与某些化合物之间的亲合力来分离有效成分。如用葡聚糖凝胶或酸化的琼脂糖凝胶分离凝集素;二、研究酶的结构与功能;三、实例