色谱柱使用及维护.pptVIP

色谱柱的使用与维护; 实验室常用色谱柱：C8柱、C18柱、氰基柱、苯基柱、氨基柱、手性柱、离子交换柱 不同色谱柱的选择依据 色谱柱的结构 良好的色谱柱使用习惯及维护 建立方法时应注意的事项 色谱柱失效的特征指示 ;色谱柱类型;一般色谱柱选择的依据： 以反相色谱为例： 当被两种以上的分析物的疏水性存在较大差异时，选择一般的C8/C18即可；当被分析物疏水性相差无几，但氢键作用相差较大时，可选用氰基柱、氨基柱；苯基柱对含有不同芳环的芳香化合物具有较好的分离能力；对离子性化合物，可采用离子交换柱或者离子对反相色谱柱;不锈钢柱管：可用于所有的有机溶剂与大多数水性缓冲液，然而含氯的流动相会缓慢地“卤素腐蚀”不锈钢柱管，尤其是低pH条件下 柱管不锈钢成分（铁、镍、铬）牢固络合的样品可能发生这类问题，但因为色谱柱内壁的表面积很小，发生不良反应的机会不大 ;多孔烧结物（滤片）：封闭色谱柱的两端，固体色谱柱的填料 一般来说，5um与3um的微粒分别用2um与0.5um孔径的不锈钢滤片 发生不良反应的可能比色谱柱内壁大得多 峰型不好与样品回收率低可能预示滤片出现问题 ;压帽：即色谱柱两端套合于柱管端外壁的塑性圆柱帽，中部有小孔，多为聚四氟乙烯制成，用于固定筛板 密封环：位于接头螺旋环内壁的弹性环，多为聚四氟乙烯制成，用于色谱柱两端压帽与柱外壁的密封 柱填料：色谱柱担体，常用的填料为硅胶、多孔聚合物、氧化铝等 ;优点 优良的物理特性 可控的成熟工艺 理想的表面活性 优良的溶剂兼容性（不存在不溶胀）;缺点 在高pH条件下，硅胶溶解 ;;良好的色谱柱使用习惯;使用前的准备工作 阅读使用说明书（特别注意使用事项、pH范围、保存条件）→按要求活化色谱柱→测定柱效，记录色谱柱参数信息→流动相平衡色谱柱进样 建议：建立色谱柱信息台账（项目所属的色谱柱的柱压、拖尾因子、分离度、进样时间），定期对色谱柱进行柱效的测定 建议：色谱柱项目专用----频换的更换流动相很容易降低色谱柱的寿命，并容易造成试验保留值的漂移;;实例 ;日常维护： 每次分析结束后色谱柱的清洗 反冲不同厂家不一致： 月旭----正向使用，反向冲洗 Agilent----优先正向，最后反冲 Phenomenex----反冲 迪马-----反冲;特殊维护----色谱柱出现异常的维护 ;柱压高---建议： a)将水通道与缓冲盐定期进行清洗； b)密封垫与转子磨损造成的微粒是堵塞色谱柱滤片的主要来源，定期更换泵密封垫与进样阀转子一般能减少滤片的堵塞； c)在开发分析方法时注意缓冲盐与有机相的互溶性，尤其是在梯度洗脱; d)接保护柱 ;固定相流失的原因： 硅胶基质的流失---高水、高温、高pH 键合相的流失----低pH、高水 建议： 流动相pH、水相限制在色谱柱的使用范围内 ;强保留物质的积累：导致色谱峰拖尾，展宽 建议的解决方法：不同厂家色谱柱不一致。 详见各厂家建议的色谱柱冲洗程序。;前延峰 拖尾峰 裂缝或分叉峰 胖头峰或馒头峰 保留时间波动较大;前延峰 ;;可能原因： a)填料丢失，多见于酸性物质 ，换柱 b)溶剂效应，采用流动相溶解样品 解决方法： 换柱 采用流动相溶解 增加缓冲盐的浓度，抑制次保留效应 提高柱温，加快传质速率;拖尾峰 ;可能原因： 样品过载 次保留效应，尤其是碱性物质 填料中残留的痕量金属离子 流动相试剂中的金属离子 不合适的缓冲盐溶液;解决方案： 降低进样量 加入扫尾剂（酸---1%乙酸；碱----10mmol/ml三乙胺，三乙胺无效，可改为EDTA） 尽量采用色谱级试剂 增加缓冲盐的浓度;产生次保留效应的因素--离子交换效应 离子交换效应：质子化的碱性分子与离子化的硅羟基发生离子交换产生次级保留效应 ;产生次保留效应的因素—痕量金属离子 金属离子所产生的强吸附位比硅羟基强50倍！！ 更易引起碱性物质的拖尾 ;严重拖尾-----强保留组分 ;严重拖尾峰的出现往往是强保留污染物在柱头进口处聚集的信号！！！ ;峰分叉 ;可能原因： 柱填料坍塌 柱过载 色谱柱中存在“空穴”（使用中避免撞击） ;解决方案： 更换色谱柱 降低进样量 ;宽峰或馒头峰 ;可能原因： 色谱柱方面：1、柱填料坍塌；2、色谱柱或保护柱被污染；3、过载 流动相方面：流速过低、缓冲盐浓度、流动相比例 柱外效应：样品池过大、色谱柱与检测器的链接管路较长、记录仪相应时间不