高中生物奥赛辅导生化——核酸资料.ppt

第五章???核 酸;第四节 核酸的性质;（三）酶水解 非特异的磷酸二酯酶： 蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5’-核苷酸 牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3’-核苷酸 特异的磷酸二酯酶： 核酸酶;1、核酸酶的分类 底物专一性： 核糖核酸酶 RNase 脱氧核糖核酸酶 DNase 作用方式： 核酸外切酶（exonuclease)、 核酸内切酶 (endonuclease)。 单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶 磷酸二酯键的断裂方式： 5’-（寡）核苷酸 3’-（寡）核苷酸 ;RNase H 作用于DNA-RNA中的RNA链 牛胰核糖核酸酶（pancreatic ribonuclease) , RNase I 最适pH ：7.0-8.2 产物：以3’-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸，高度专一的内切酶 RNase T1 耐热、耐酸 产物：以3’-鸟苷酸结尾的寡核苷酸，专一性更高 RNase T2 产物：以3’-腺苷酸结尾的寡核苷酸;核酸酶S1 作用于单链DNA部分 牛胰核糖核酸酶，DNase I 切断双链或单链DNA 产物：以5’-磷酸为末端的寡核苷酸 DNA限制性内切酶 具有非常严格的碱基序列专一性;以限制性内切酶及连接酶进行核酸剪接;目标基因殖入质粒并转化宿主菌;二、? 核酸的酸碱性质 P504 核酸的磷酸基具有酸性，碱基具有碱性，因此，核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸性大于碱基的碱性，其等电点偏酸性。DNA的pI约为4～5，RNA的pI约为2.0～2.5，在pH7～8电泳时泳向正极。;三、? 核酸的紫外吸收 碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有强烈的光吸收，　λmax=260nm;1、鉴定纯度 纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85） 纯RNA的A260/A280应为2.0。 若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。 2、含量计算 1 ABS值相当于：50ug/mL双螺旋DNA 或：40ug/mL单链DNA（或RNA） 或：20ug/mL寡核苷酸 3、判断DNA是否变性 在DNA的变性过程中，摩尔吸光系数增大（增色效应） 在DNA的复性过程中，摩尔吸光系数减小（减色效应）;四、? 核酸的变性、复性及杂交;第四节 核酸的性质;1).DNA的变性现象 将DNA的稀盐溶液加热到80--1000C,几分钟后,DNA将发生一系列的物理化学性质的改变(宏观表现). 260nm的紫外吸收值升高.(增色效应) 比旋下降. 粘度下降. 浮力密度升高. 酸碱滴定曲线改变. 生物活性丧失. ;增色效应与减色效应 增色效应：DNA变性过程中，摩尔吸光系数增大。 减色效应：DNA复性过程中，摩尔吸光系数减小。;核酸的变性与复性;Hyperchromic Effect 核酸变性观察;2、 熔解温度（Tm）： DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。 浓度50ug/mL时，双链DNA A260=1.00，完全变性（单链）A260= 1.37当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。 DNA的Tm一般在82—95℃之间;3、 影响DNA的Tm值的因素;核酸 G+C 组成分越高者 Tm 越大;②G-C含量与Tm值成正比。 测定Tm，可推知G-C含量。G-C%=（Tm-69.3）×2.44;③介质中离子强度 P509 离子强度高，Tm高。 ;阳离子中和核酸的负电荷而使 Tm 增大;DNA分子的复性;DNA分子的复性;核酸复性的速度与其基因组复杂度有关 p510;分子杂交;1、Southern Blotting DNA样品 → 酶切 → 电泳 → 碱变性 → 转膜 → 固定 → 杂交 → 洗涤 → 放射自显影 Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。;核酸分子间的杂交反应 hybridization;Northern blotting（印迹法）;Southern Blotting 的转印; 取出转印纸以探针杂交呈色 ;2、?? Northern Blotting 研究对象是mRNA，探针一般是DNA。 总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛） 3、?? Western Blotting 抗原与抗体的杂交 研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。 ;;;第五节?核酸研究技术;（一）DNA分离纯化 真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低盐溶液（0.