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第三章 物理图绘制;用遗传学技术作图对于指导基因组计划的测序 阶段还是远远不够的，因为遗传图谱的局限性： 遗传图的分辨率有限：依赖于所得到的交换数目。 遗传图的覆盖面较低：重组热点、极少重组区段的存在。 遗传图的准确率有限：环境因素和取样误差，分子标记的排列有时会出现差错。;物理图谱是以物理距离来表示各遗传标记之间或DNA序列两点之间在DNA分子上的位置，以实际的碱基对长度来度量其物理距离。 ;1）限制性作图（Restriction mapping）： 它是将限制 性酶切位点标定在DNA分子的相对位置。 2）基于克隆的基因组作图 (Clone-based mapping) ： 根据克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群 (Contig), 绘制物理连锁图。 3）荧光原位杂交（Fluorescent in situ hybridization, FISH）： 将荧光标记的探针与染色 体杂交确定分子标记的所在位置。 4）序列标签???点作图 （Sequence tagged site, STS）： 通过PCR或分子杂交将小段DNA序列定位在基因 组的DNA区段中。;3.1 限制性作图;3.1.1 限制性作图的基本方法;§3 Physical mapping §3.2 限制酶作图;限制性片段越大，切点越多，需要比较的片段也会增加，而且当片段多到一定程度，一些大小相似的片段会重叠在一起，不可能组成一个清晰的图谱。因此，限制性作图更适合于小分子。 实际应用中如果DNA分子小于50kb，通常可以选用识别6个核苷酸序列的限制酶来建立清晰的限制性图谱。 一个较简单的变通策略使我们可以忽略大量的片段。这种方法是将标记物加到要分析的DNA分子两端，进行部分酶切处理后，很多产物成为不可见的，我们利用可见的部分大小，确定那些未定位的切点与DNA分子末端的相对位置。;末端同位素标记（或其他标记）结合部分酶切：形成梯形分布带 ;3.1.2 限制性作图的局限;稀有切点限制图绘制;稀有切点限制酶;选用稀有切点限制酶酶切大片段DNA 预测稀有切点限制性内切酶酶切片段大小;PFGE的基本原理 将一个方向不断变换的电场，取代简单的单一电场（单向电场，使电泳中受阻的DNA分子在电场改变时扭转迁移方向，较小的分子比较大的分子重新排列的快，以此达到分离的目的。分辨率达到10Mb。 常规琼脂糖凝胶电泳可分辨30kb以下的线性分子，脉冲凝胶电泳可分辨10Mb的大分子;常规与非常规琼脂糖凝胶电泳;垂直交变电场电泳;均一脉冲电泳;大肠杆菌基因组物理图;3.2 基于克隆的基因组作图---大分子DNA的克隆;3.2.1 载体 质粒、噬菌体、粘粒…… 啤酒酵母基因组主要是先构建粘粒文库，然后建立克隆重叠群完成测序 高等生物基因组 拟南芥1.2X105bp，需要25000个克隆 人类基因组是拟南芥基因组的33倍;酵母人工染色体（YAC）; YAC文库装载的DNA片段的大小一般可达 200-500kb，有的可达1Mb以上。 ;YAC的主要缺点：1．存在高比例的嵌合体，即一个YAC克隆含有两 个本来不相连的独立片段；2．部分克隆子不稳定，在转代培养中可能会发 生缺失或重排；3．难与酵母染色体区分开，因为YAC与酵母染色 体具有相似的结构;4．转化效率低。 ;;细菌人工染色体（BAC）：以细菌F因子为基础，人工构建的环状的DNA分子。可以携带大于100-350Kb的外源DNA片段。 选择标记：氯霉素抗性基因等。 BAC载体的优点： 较为稳定；没有嵌合现象； 转化效率高； BAC克隆易于操作和DNA提取； BAC文库筛选方便。;质粒*;基因组文库：指将基因组DNA通过限制性内切 酶部分酶解后所产生的基因组DNA片段随机的 同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体 代表了某种有机体整个基因组。 1) 目标基因组大分子DNA的制备； 2) 载体制备； 3) 载体和DNA的连接； 4) 转化； 5) 转化子鉴定。; 目标基因组大分子DNA的制备;插入大分子DNA的分离;载体制备与插入DNA连接;染色体步移; 3.2.3 指纹作图—3种指纹;指纹作图 限制性带型指纹：用不同限制性酶处理样品，凝胶分析，DNA条带有部分相同，说明它们含有重叠的序列 重复序列DNA指纹：不同克隆酶解电泳，转移到杂交膜中，用一种或几种基因组范围的重复序列作为探针杂交，出现相同的杂交带型，说明重叠 重复序列DNA PCR：设计与