majun-基因工程-分子基本操作技术课题.ppt

第四章 分子基本操作技术;核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的方式存在的 真核生物95%的DNA存在于细胞核内，5%的DNA在细胞器 75%的RNA存在于细胞质，10%在核内，15%在细胞器 其中rRNA（80～85%） tRNA及核内小分子RNA（10～15%） mRNA（1～5%）;第一节 DNA的基本操作技术;DNA提取的几种方法 1、染色体DNA的提取 CTAB法 SDS法 其它 2、非染色体DNA的提取 质粒DNA的提取，包括碱裂解法和煮沸法 线粒体、叶绿体DNA的提取，主要是差速离心结合SDS裂解法;基因组DNA－ CTAB法;　CTAB提取缓冲液的经典配方;　CTAB法流程图;基因组DNA－SDS法; SDS法流程图 （以动物组织为例） ;基因组DNA－其它方法;质粒DNA－碱裂解法;　碱裂解法流程图;DNA提取的基本步骤;材料准备;细胞裂解;核酸分离、纯化;蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤 蛋白酶处理 多糖的去除： 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μL DNA液中加入200μl 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl) ，冰浴20min。;多酚的去除： 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合 盐离子的去除： 70％的乙醇洗涤;核酸沉淀、溶解;基因组DNA的检测;DNA提取常见问题; ; ;第二节 RNA基本操作技术;提取RNA的注意事项;常用RNA酶抑制剂;RNA提取的步骤;材料准备及裂解;杂质的抽提;RNA的沉淀和溶解;RNA的检测;RNA提取常见问题; ;