过表达人源E46K突变体αsynuclein对蛋白质降解系统的影响.pdfVIP

姆Ⅲ??甲基腺苷??淮ズ说鞍?自噬溶酶体途径过硫酸铵牛血清白蛋白放线菌酮伴侣分子介导的自噬免疫共沉淀氯喹焦炭酸二乙酯达氏改良伊氏培养基二甲基亚砜厄氏平衡盐缓冲液增强化学发光胎牛血清绿色荧光蛋白羟氯喹免疫荧光马血清?甁?氨基末端激酶?乳孢素?甅??????????????????????????????????????????‘?????????—??????????????’??畉????一??? 猠???????????????．????????????????? 摘要一、过表达??突变体?畇?对蛋白质降解系统的影响帕金森病?????’?????琍?是临床最常见的中枢神经系统退行性疾病之一，主要发生于中老年人群。在我国?岁以上人群发病率约为??％，发病人数超过??颉??诓±硌?现饕1硐治V心院谥手旅懿慷喟桶纺苌窬?Q≡?性丢失以及残存神经元胞体中有蛋白质包涵体被称为路易小体?????的出现。??闹饕3煞质莂一突触核蛋????????琣??????个氨基酸残基组成。?的发病机制目前尚未完全阐明，遗传学研究表明编码?荆畇?的基因点突变??ˋ??珹??珽??及过表达与?的发生有密切关系，但异常表达的Ⅱ一??亩拘曰?迫圆磺宄?＝?昀囱芯勘砻鱟?畇?异常表达与蛋白质降解系统功能异常密切相关。在本研究中，我们主要对过表达和??突变体值．??缘鞍字式到庀低车挠跋欤?渥陨碓谙赴?诘慕到馔揪逗徒到馑俾室约岸?细胞的毒性进行研究。我们发现在??和???细胞上稳定及瞬时过表达??突变体?畇?可显著抑制自噬底物蛋白??慕到獠⒋俳?渚奂?Ｍ?盓??槐涮?【．?????挠跋炀哂凶允梢览敌浴Ｕ庑┙峁?崾疚颐枪?泶顴??槐涮逯担畇?损伤自噬功能。随后我们发现过表达??突变体??畇?对自噬的抑制作用发生在减少自噬吞噬体的形成而对溶酶体的功能没有显著影响。进一步机制研究发现，发现过表达??突变体?荆畇?可通过抑制?甁?氨基末端激酶??甁??琂??的磷酸化导致???磷酸化水平降低，同时增加自噬抑制性???合物???／????男纬刹⒔档妥允纱俳?愿春衔顱???／???男纬桑????制自噬的发生。过表达??突变体?．??跃?涞牟溉槎?锢着撩顾匕械鞍????????琺??介导的自噬调节信号通路无显著影响。我们还发现与??突变体???煌??泶镆吧??????，???畇?不影响细胞基础自噬和饥饿诱导的自噬。此外，过表达??突变体?畇?可抑制泛素蛋白酶体系统的功能并增强伴侣分子介导的自噬?????．??????水平。二、??突变体?畇?在细胞内的降解途径我们的研究发现，在??稳定株细胞中，??突变体?荆畇?主要通过蛋白酶体和大分子自噬途径所降解，??荆畇?主要通过蛋白酶体和伴侣分子介导的自噬?????猰?????????珻??揪端?到狻４送猓?隬?鞍紫啾龋???突变体?．??赑??赴?诘慕到馑俾氏灾?档汀????，?畉?????????????????????????．?????????? 三、过表达??突变体?畇?对细胞的毒性作用关键词：帕金森病，?荆畇?，??，自噬，??我们的结果表明，稳定表达??突变体?荆畇?的??细胞表现为形态学的异常，包括形状变大和异常。在神经生长因子??????，??分化处理下，空载体组细胞出现完整的细胞突起，而转染??突变体????南赴?对??拿舾行越档汀４送猓?诜只?腜??赴?校?泶顴??槐涮錛??可增加细胞对鱼藤酮?????琑??鴏?さ拿舾行裕?硐治O赴?盍?峡赵靥遄?细胞显著降低，凋亡率显著增加以及细胞内活性氧?????水平显著升高。综上所述，??突变体?荆畇?可抑制细胞的自噬功能，其机制可能通过抑制??的磷酸化导致自噬吞噬体的形成减少。其次，??突变体?荆畇?可抑制??δ艿贾露嗑鄯核鼗?鞍椎木奂?⒋?バ陨?逤?活性。而过表达??荆畇?对细胞的自噬和??δ芫?尴灾?跋臁４送猓珽??槐涮?【??与??畇?在降解途径和降解速率上也有所不同，前者主要通过自噬和蛋白酶体途径降解，后者主要经蛋白酶体和??揪督到狻Ｓ隬?鞍紫啾龋珽??槐涮??荆畇?在细胞内的降解速率显著降低。最后，过表达??突变体???可增加细胞对??碳さ拿舾行浴?????琑?????????????????．??????????????? 甿????一．???????????荆畇??琣?????????????．??????甃????????瑆?????甅????，??????疭????????????????????甈???????％????琣???????．????????????甌?????．??????．??????，?；?????????瓻?????—????????甀????甀??．??甆?????瓼????甁????值一?????，?琭???????疺??????琣