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PCR扩增技术
PCR扩增技术;一．实验目的及背景 ;模板ＤＮＡ在９４℃条件下变性形成单链； 在５５℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合；７０℃下在耐热性ＤＮＡ聚合酶Taq 酶催化下， 在４种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。 接着又以新合成的ＤＮＡ为模板进行同样反应，如次往复循环30次，由于每次循环目标ＤＮＡ都以２n次幂扩增，３０次循环后目的DNA的量增加１０６－７倍。成功的ＰＣＲ反应要求反应有很好的特异性和相当的扩增效率。 要达此目的ＰＣＲ反应要注意以下问题：
;ＤＮＡ模板：反应中ＤＮＡ量在５０ng～２００ng左右。且ＤＮＡ纯度较高， 以增加反应特异性。
dNTP:反应体系中达100μM～200μM。
Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基,浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。
引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40 ％－70％之间；引物内部不能有回文序列；引物３’端不能互补。
;Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚合酶，在９５℃时３０分钟还有５０％活力。
变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。
复性温度：５５℃左右，此温度选择是根据模板和引物配对结合强弱而定， 它是反应特异性的决定因素。
延伸温度：７０～７２℃左右，为Taq酶最适反应温度。;１０×buffer: 500mM KCl
100mM Tris-HCl (pH9.0)
0.1% 明胶
1% TritonX-100
MgCl2 2.5mM
４×dNTP: 1mM
引物：actin上， actin下
模板： 20ng/μl
Taq酶： 5u/μl
PCR仪，凝胶成像系统，电泳系统
;PCR仪 凝胶成像系统;三. 实验方法;反应体系混匀，离心
在ＰＣＲ仪上按以下方式循环
９4℃变性 5分钟
９4℃变性 45秒
30个循环 55℃退火 45秒
72℃延伸 1分钟
７２℃延伸反应10分钟。
取5μl反应液加4μl Loading buffer在１.５％琼脂糖凝胶上120伏，电泳2小时。
在凝胶成像系统上观察记录实验结果 ;四. 结果分析
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