SiRNA与RNAi实验技术.ppt

SiRNA与RNAi实验技术;1990年，Jorgenson 在矮牵牛花中发现转基因沉默。 1995年，Guo 注入反义RNA及正义链RNA都能抑制线虫par-I基因的表达。 1998年，Fire 和 Mello 研究证实在正义RNA阻断基因表达实验中，真正起作用的是双链RNA，于是提出了RNAi。（2006年诺贝尔生理学或医学奖） 2001年，Elbashir 等在《Nature》上首次报道通过21nt的siRNA成功地在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉默。;RNAi的研究史;RNAi的发现;RNAi的发现;RNAi的发现;什么是siRNA和RNAi？ ;RNAi的作用机制 ;The Mechanism of RNA Interference ;RNAi的特征 ;RNAi技术的应用 ;RNAi国内外研究现状和发展趋势;如何进行RNAi实验的设计？ ;设计siRNA序列 siRNA的获得 siRNA的转染 RNAi的效果分析 ;设计siRNA序列;设计siRNA序列;设计siRNA序列;设计siRNA序列;siRNA的获得 ;siRNA的获得;siRNA的获得--体外制备;siRNA的获得--体外制备;;c、用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA 其他制备siRNA的方法的缺陷是需要设计和检验多个siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。而用这种方法制备一份混合有各种siRNAs “混合鸡尾酒” 就可以避免这个缺陷。选择通常是200-1000碱基的靶mRNA模版，用体外转录的方法制备长片断双链dsRNA ，然后用RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一种siRNAs“混合鸡尾酒”。在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。 最适用于：快速而经济地研究某个基因功能缺失的表型。 不适用于：长时间的研究项目，或者是需要一个特定的siRNA进行研究，特别是基因治疗。 ;１、含有T７启动子的PCR产物 的合成;siRNA的获得--体内表达 ;;siRNA的获得--体内表达;siRNA的获得—方法小结;siRNA的转染 ;siRNA的转染;siRNA的转染;siRNA的转染;siRNA的转染;siRNA的转染;RNAi的效果分析 ;siRNA实验成功的要点 ;RNA 操作时的注意事项与实验技巧 ;RNA 操作时的注意事项与实验技巧;RNA 操作时的注意事项与实验技巧;问题与猜想 ;问题与猜想;问题与猜想