基因克隆与表达解答.ppt

蛋白原核表达; 目的基因-T 表达载体 酶切， 胶回收，连接 转化到克隆用细胞（Top10) 提质粒，酶切验证 转化到表达用细胞（BL21（DE3)） 诱导表达 SDS;DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。 ;3）. 温度 ;用时在冰上操作； 取酶用干燥、灭菌、新的枪头 酶用量不能超过酶切总体积的10%； 多种酶进行酶切时，先低盐后高盐缓冲液；;连接、转化与重组子鉴定;（1）必须是两条双链DNA。; ? ATP：反复冻熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，连接缓冲液宜分装； ?单价离子：150-200mM NaCl，提高连接效果； ? PEG：5%以下可以提高连接效率;?目的或作用：; 化学法（CaCl2法)：;影响转化率的主要影响因素:;ROP;质粒DNA的提取;ⅰ质粒DNA提取方法：;ⅲ 抽提出质粒的构型：;抽提出的质粒三种构型电泳结果：;凝胶电泳技术;? 凝胶分辨DNA的能力：;电泳缓冲液;pET表达载体;;;;pET表达载体的启动子是T7噬菌体基因10启动子（T7启动子），需要T7RNA聚合酶才能转录。 T7RNA聚合酶转录机制十分有效并具有选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；在非诱导条件下，几乎可以使目的基因完全处于沉默而不转录。 T7RNA聚合酶基因插入由大肠杆菌lacUV5启动子控制、λDE3溶原状态下的大肠杆菌染色体上。 ; T7 表达系统 转录调控的机理 化学诱导型 噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生 株，一段含有 lacI、lacUV5 启 动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中 用噬菌体 DE3 的溶源菌作为表 达载体的宿主菌，调控方式为 化学诱导型，类似于 Lac 表达 系统。;BL21 :lon, ompT BL21(DE3) : T7 polymerase Rosetta: optimal codons Origami : thioredoxin reductase (trxB) , glutathione reductase (gor) Rosetta-gami Origami B: (IPTG concentration dependent);基本原理;基本步骤;加入分离胶溶液 pH 8.8;分离胶 pH 8.8;加入电极缓冲液pH 8.3;凝胶板剥离与染色;结果分析;谢谢！