血红蛋白的提取和分离(上课)资料.ppt

一、血红蛋白的提取和分离;; 用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？;3、蛋白质分离和提取的原理：P64;（一） 凝胶色谱法（分配色谱法）;3.凝胶色谱法的原理;凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示;相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个（ ）;（二）缓冲溶液;3.缓冲溶液的配制:;样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定;(1)红细胞的洗涤:;(2)血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。;甲苯层（无色透明）;(4)透 析：;透析过程动画演示;2.凝胶色谱操作:;;①凝胶的选择： A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。 B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 ②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 ;③凝胶色谱柱的装填： A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。 B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 注意： 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 ; ;（3）样品加入与洗脱;③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 ④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。;注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。;在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功;思考下面的问题：;1.样品的处理——通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液 2.样品的粗分离——经过透析去除分子量较小的杂质 3.样品的纯化——通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去 4.纯度鉴定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。;（三） 电泳：;;; 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。（SDS的作用）为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS。;（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）; 观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。; 如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。; 教学反馈 ;5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（ ）的含量最多。 A白细胞 B血小板 C红细胞 D淋巴细胞 6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（ ）。 A. NaCl B.甲苯 C.蒸馏水 D.柠檬酸钠 7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层， 其中第3层是（ ） A无色透明的甲苯层 B脂溶性物质的沉淀层 C血红蛋白的水溶液 D其他杂质的暗红色沉淀物;