生物制药第四章.pptVIP

2010年6月生物制药;内容;第四章 基因工程制药;（一）基因工程（gene engineering）的概念 又称为遗传工程、重组DNA技术，是按着人们的科研或生产需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质（DNA片段），在体外切割，拼接形成重组DNA,然后将重组DNA与载体重新组合，再将其引入到没有该DNA的受体细胞中，进行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创造出生物的新性状，并使之稳定地遗传给下一代。 按目的基因的克隆和表达系统，分为原核生物基因工程， 酵母基因工程，植物基因工程和动物基因工程。基因工程具有广泛的应用价值，为工农业生产和医药卫生事业开辟了新的应用途径，也为遗传病的诊断和治疗提供了有效方法。基因工程还可应用于基因的结构，功能与作用机制的研究，有助于生命起源和生物进化等重大问题的探讨。 ???; 基因工程有两个重要的特征 第一是可把来自任何生物的基因转移到与其毫无关系的任何其他受体细胞中，因此可以实现按照人们的愿望，改造生物的遗传特性，创造出生物的新性状； 第二是某一段DNA可在受体细胞内进行复制，为准备大量纯化的DNA片段提供了可能，拓宽了分子生物学的研究领域。;1 基因工程诞生的理论基础（理论上的三大发现） （1）40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，从而明确了遗传的物质基础问题； （2）50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制和传递的问题； （3）50年代末期和60年初，相继提出了中心法则和操纵子学说，并成功的破译了遗传密码，从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。; ; ;4 DNA测序技术的建立进一步促进了基因工程的发展;（三）基因工程基本原理和流程;;第二节??基因工程中常用的工具酶和载体;限制性内切核酸酶(restriction enzymes);限制性内切酶分类;限制性酶EcoRI识别位点（粘性末端）;EcoRI酶切不同来源的DNA及退火重组;平齐末端（SmaⅠ）;限制性内切酶的命名;DNA聚合酶的特性;该酶的用途是将带匹配黏端的双链DNA或平端双链DNA片段的5’- P 与另一也带相应缺口的DNA片段的3′ - OH 连接起来 ;不匹配黏端的连接 先补平或修平后再连接;（二）???基因工程载体;载体必须具备的条件;; ● 严谨型质粒——每个细胞中有1-2个拷贝，具有自身传递能力，分子量大。  ●松弛型质粒——每个细胞中有10-100个拷贝，不具有自身传递能力，分子量小。基因工程常用此类质粒。 ○ 常用的质粒有：pBR322、Psc101、ColE1、Psc134等。 ○ 质粒载体一般能克隆10Kb左右的DNA片段。; 基因工程制药的关键技术;（一）PCR的原理和应用;（一）PCR的原理和应用;（1）变性（denaturation）：模板DNA经热变性，双链被解开，成为两条单链。;2. PCR技术的关键酶DNA聚合酶; （二）???目的基因的获取; ● 基因的人工合成 ○ 如果已知某基因的核苷酸序列，或者通过基因产物的氨基酸序列推导出基因的核苷酸序列，就可将单核苷酸或寡核苷酸一个一个缩合起来，成为一个基因的核苷酸序列。连接的两个分子各有一端被封闭。 ○ 先合成分别属于双链序列的8-12碱基的片段，两个片段的对应部分配对后留有粘性末端，第三个片段再连接上去，不断延伸直至全部合成; ;RT-PCR; ;;; ;;脂质体包埋法; ;腺相关病毒;;2、根据报告基因筛选克隆子 对于那些不宜采用克隆载体选择标记筛选克隆子的宿主细胞，往往在目的基因连入载体之前，先在目的基因的上下游连接一个报告基因，这样导入宿主细胞后可根据报告基因的表达产物筛选克隆子。; ;;;;;3）印迹杂交法 ○ Southern blot(Southern印迹试验)原理——利用硝酸纤维薄膜（或滤纸、尼龙膜）具有吸附DNA的功能，先作DNA凝胶电泳，并将凝胶电泳的DNA区带吸附到膜上，然后在膜上进行同位素标记探针与被测样品只间的杂交，在通过放射自显影对杂交结果进行检测。 ○Northern杂交：制备目的基因DNA探针，变性后同克隆子总的RNA杂交。若出现明显的信号，可以认定进入宿主细胞的目的基因转录出相应的RNA;4）原位杂交：可分为克隆和噬菌斑原为杂交，二者的原理相同：转化后得到的菌落和噬菌斑转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，可得到一个与平板菌落或噬菌斑分布完全一致的复制品，进行菌落裂解、DNA变性、中和、接下来用放射性核素标记的探针进行杂交，洗涤移去多余的探针，将滤膜干燥后放射自显影，可得到杂交阳性的