小麦的V型氢离子泵亚基基因显著影响盐抗性在拟南芥中资料.docxVIP

wheat V-H+-ATPase Subunit Genes Significantly Affect Salt Tolerance in Arabidopsis thaliana 小麦的V型氢离子泵亚基基因显著影响盐抗性在拟南芥中 V-type：水解ATP产生能量，但不发生自磷酸化，从细胞质基质中泵出H＋进入细胞器，保持细胞质基质中性pH和细胞器内的酸性pH ，位于动物溶酶体膜、植物液泡膜上 。 从耐盐的小麦突变体RH8706-49中鉴定和克隆出了V型氢离子泵（V-H+-ATPase）的亚基基因。这些基因的序列在植物中是高度保守的。在拟南芥中这些基因的过表达提高了他的耐盐性，增加了V型氢离子泵的活性，促进了Na+/H+的交换，在植物中这些大量的增加是由于携带 V型氢离子泵的C亚基.。从数量RT-PCR分析中得到的结果显示，拟南芥中在盐胁迫下，每一个V型氢离子泵的mRNA水平都增加了。总之，我们的结果显示，每一个V型氢离子泵亚基在植物增强抗盐性中都有至关重要的作用。 盐胁迫是对植物生长产生不利影响的主要因素。它可能导致细胞质中Na+浓度的升高，导致渗透压胁迫和离子中毒。盐胁迫还可能造成大幅度减产。因此，增加植物的抗盐性在农业中有极大的兴趣。 氢离子泵在质膜和大量内膜系统中被发现。它们在建立跨液泡膜质子梯度中至关重要，这个梯度提高了液泡膜Na+区域化和植物耐盐性。这里有两种功能的氢离子泵的种类。第一种，像F型的氢离子泵，通过跨膜化学势合成ATP。第二种，像P型和V型的氢离子泵，水解ATP产生跨膜质子势。在盐地碱蓬中（学名：Suaeda salsa，东北称翅碱蓬，河北称黄须菜，内蒙古称碱葱，为苋科碱蓬属的植物），V型氢离子泵的表达增强是被认为对盐抵抗的最主要机制。在液泡中表达增强的V型氢离子泵提供了了跨膜质子运输的重要能源。V型氢离子泵的活性的增加被发现不是由于这个酶结构的改变引起的，而是它的一个基因表达量增加引起的。 高盐浓度可以增加液泡的V型氢离子泵的mRNA水平。在冰叶日中花中（Mesembryanthemum crystallinum双子叶植物纲，番杏科，日中花属）?，盐处理增加了A,B,C,D,E,F,G,c亚基mRNAs的转录。盐胁迫和盐适应的烟草悬浮培养细胞中也表现出A亚基的mRNA水平升高。在甜菜中（Beta vulgaris?L.）和它的悬浮培养细胞中，NaCl刺激A和c亚基的协调变化。在盐地碱蓬中，盐胁迫增加了B和C亚基的转录和翻译。SaVHAc1, LbVHA-c1 和ThVHAc1增强了转基因植物的抗盐性。我们之前获得了E和B亚基的序列，然后发现，盐处理提高了这些亚基的表达。这些亚基在野生型拟南芥中过表达增加了转基因拟南芥的抗盐性。 这里，我们用RT-PCR技术，从一个小麦的抗盐突变体(RH8706-49)克隆了除了E和B亚基以外的其他亚基，研究这些亚基的过表达在拟南芥的盐抗性中有什么作用。 材料和方法 植物 本研究中我们使用了小麦耐盐突变RH8706-49和拟南芥哥伦比亚两种材料。 微阵列分析 对耐盐小麦RH8706-49分别进行135 mM NaCl 0, 1, 6, 12, 72小时的处理。然后根部用TRIzol(Invitrogen)试剂（RIZOL是一种新型总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。其含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。TRIZOL在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性，因此对纯化RNA及标准化RNA的生产十分有用。）被用来进行总RNA的准备。总RNA用RNeasy Mini Kit Qiagen RNA提取试剂盒进行纯化。双链cDNA合成用单周期的cDNA合成试剂盒（Affymetrix），然后用基因芯片样品清理模块（Affymetrix）纯化。根据制造商的说明，该纯化的cDNA用基因芯片IVT标记试剂盒来制备生物素标记的cRNA。为了达到用于杂交的目标，生物素标记的cRNA在94°C下35分钟使之片段化。该目标和Affymetrix公司的小麦基因组阵列P / N：520254杂交，根据该检测程序进行清洗和扫描。该杂交图像用Affymetrix公司Microarray Suite 5.0软件分析并使数据标准化。聚类分析用集群和树视图软件实现。 小麦V-H+-ATP酶基因的克隆 在第二叶阶段，总RNA从RH8706-49植物中提取。cDNA合成用之前描述的方法执行。全长cDNA序列的获得和引物序列的设计都使用Primer Premier 5.0软件。 二元表达结构和拟南芥的转染 全长cDNA编码V-H+-ATP酶可通过PCR使用特定引物（表S2）和插到二元载体， pCAMBIA1300，启动子CaMV 35S的控制下，然后使用冻融法将表