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基因直接进化研究进展DNAShuffling技术
基因直接进化研究进展 ——DNA Shuffling技术; 生物的自然进化;人工获取新基因的方法;基因直接进化的用途;TLPs 的失活曲线;TLP-ste突变蛋白的三维结构;酶拓扑结构的变化;基因直接进化的步骤;建立基因突变库的方法;;易错PCR ;同序法（consensus approach）;真菌植酸酶aa序列的同序比较 ; 同序植酸酶-1的最适温度为71℃，而亲代植酸酶的最适温度为45-55℃，增加了16-26℃, 同序植酸酶-1Tm为78℃，比亲代植酸酶增加了15-22℃，而催化性质与大多数亲本植酸酶相似。 ;DNA Shuffling:
外显子、单基因和基因家族的重组装
随机引物延伸法
交错延伸法
随机片段活体突变:
线状基因和随机片段共转化酵母细胞;基因突变库的筛选方法
Screening the Library and Selecting the Right Clone;噬菌体展示、细胞表面展示
根据所需要的特性，对经Shuffling后的DNA文库在噬菌体或细菌细胞表面（细菌、纤毛虫细胞表面）的表现特征进行筛选，获得提高目的底物亲和力的突变子。
减少筛选工作量
突变文库→大的突变子库→小的突变子库→单克隆
;噬菌体展示筛选模式;DNA Shuffling技术;What happens after DNA shuffling;DNA Shuffling：指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组(Sexual Recombination)。通过改变单个基因(或基因家族，gene family)原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。;项目;How DNA shuffling works - 1;How DNA shuffling works - 2;;DNA 重组装的过程;随机引物PCR和重组装;;交错延伸PCR突变法;磷脂酶热稳定－催化活性的分子进化（Jae Kwang Song等，2000）;枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化（Huimin Zhao等，1999）;进化后的枯草杆菌蛋白酶E;耐热p-硝基苯酯酶的分子进化(Lori Giver等，1998）;β-葡糖苷酶耐热性的提高
(Mary′a Jesu′ s Arrizubieta等，2000）;Evolution of a cytokine using
DNA family shuffling
Chia-Chun J. Chang ……. Phillip Patten
Nature Biotechnology Vol. 17, August, 1999;Interferons (IFNa, IFNb, IFNg);Methods and Materials-1;Phagemid display of IFN
High-throughput phagemid preps (Q-BOT colony picker)
Antiviral assays:;phagemids; CHO (Chinese Hamster Ovary) expression and purification (His tag)
of chimeric IFN-as.
High-throughput proliferation assays (inhibition of proliferation)
in mouse L929 cells:
Standard [3H]thymidine incorporation methods--IFN-a samples
were mixed with L929 cells in 96 well plates, incubated and [H3]
thymidine added to each well. Plates were harvested on Harvester-96
and thymidine incorporation was counted on a b counter
Human Daudi cell proliferation assays:
4 most active chimeras and Hu-IFN-a2a were expressed, purified
and assayed for anti-proliferation activity on human Daudi cells ;Results-1: structure of shuffled IFNas;Results-2: Activity of parental and shuffl
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