实验三质粒DNA的提取2.pptVIP

实验二 质粒DNA的分离提取;实验目的;实验原理;质粒类型;松弛型质粒 松弛型质粒的复制需要DNA聚合酶Ⅰ，在细胞生长周期中随时可以复制，每个细胞中有10－200个以上的拷贝，有的甚至达到上千个。;质粒的应用;三大要素： 多克隆位点 选择标记 （耐药性，LacZ） 独立的复制单位;T-载体;分离质粒DNA方法;碱变性法基本原理;实验仪器、材料与试剂 ;;;;;;（二） 材料 ;;（三） 试剂 ;2. SolutionⅠ 　50 mmol/L 葡萄糖 　 25 mmol/L Tris.·Cl (pH 8.0) 　 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 高压灭菌后，4℃保存备用。 3. SolutionⅡ(现用现配制) 0.2 mol/L NaOH 　 1% SDS ;4. Solution Ⅲ（100 ml） 5mol/L KAc 60 ml 冰醋酸 11.5 ml 水 28.5 ml 配制成的溶液Ⅲ含3 mol/L钾盐、5 mol/L醋酸 （pH 4.8）。 5. 氨苄青霉素（Amp） 用无菌水配制成100 mg/ml 溶液，置-20℃冰箱保存备用。 ;6. 胰RNA酶 将胰RNA酶（RNA 酶 A）溶于10 mmol/L Tris.Cl (pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中， 配成10 mg/ml的浓度，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。 7. 氯仿，乙醇 ，70%乙醇。;质粒提取的实验步骤 ;7. 12,000rpm，离心10min，将上清移至1个新Eppendorf 管中，注意所取体积（约400 μL ） 。 6. 加入等体积氯仿（约400 μL ），混匀（注意动作轻）。12,000rpm，4℃，离心10min，取上清液。 7. 上清液中加入预冷的等体积异丙醇，-20℃沉淀 20~30 min。 8. 12,000 rpm离心15 min。;9. 去上清，沉淀加入500μL 70%乙醇洗涤2次（ 12,000 rpm离心3分钟）。 10. 去掉上清（注意沉淀勿丢失），室温或真空干燥沉淀。 11. 每管中加入25μL无菌水1μL RNase， 37℃溶解质粒DNA。;实验结果及讨论;试剂盒操作方法;