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蛋白质分离分析方法之四：——电泳技术2010.10;;2. 影响蛋白质的泳动速度的因素：;;若将带静电荷Q的离子置于电场中，它的受力简单分析如下： 电荷引力： F引＝EQ 根据Stokes公式，运动中的颗粒在溶液中受到阻力： F阻＝6π r η ν 平衡时，有 F引＝F阻，即 EQ＝6 π r η ν 整理后得： ν＝EQ/（6π r η） 式中：E——电场强度； r——球形粒子的半径； η——溶液的粘度系数； ν——带电粒子运动速度。;3。电泳分类;3.1 自由电泳在溶液中进行 方法是先在U-形管内使蛋白质溶液和缓冲液之间形成清晰的界面，然后加一电场(图)，界面就会移动，每个移动界面(峰)相当于某一特定的蛋白质。 由于界面处存在浓度梯度，利用适当的光学系统可以观察到界面(电泳照相谱中的峰)的移动，吸收峰的面积代表了蛋白质的含量。 ;3.2 区带电泳——在固体支持物上进行; 按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为：;凝胶电泳－最常用的介质有： （1） 聚丙烯酰胺凝胶（分离蛋白质） （2） 琼脂糖凝胶（分离核酸）。 这两种凝胶电泳的分辨率都很高。 另有：琼脂、硅胶、淀粉胶等;聚丙烯酰胺凝胶是分离蛋白质时最常用的凝胶，可以制作成平板或柱子（图）。故又称为平板凝胶电泳和柱状凝胶。 ;;;4. 电泳技术的应用：;纸电泳用于血清蛋白质分离已有相当长的历史，在实验室和临床检验中都曾经广泛应用。自从1957年Kohn首先将醋酸纤维薄膜用作电泳支持物以来，纸电泳已被醋酸纤维薄膜电泳所取代。因为后者具有比纸电泳电渗小、分离速率快、分离清晰、血清用量少以及操作简单等优点。;琼脂经处理去除其中的果胶成分即为琼脂糖。由于琼脂糖中硫酸根含量较琼脂为少，电渗影响减弱，因而使分离效果显著提高。 例如血清脂蛋白用琼脂凝胶电泳只能分出两条区带（α-脂蛋白、β-脂蛋白），而琼脂糖凝胶电泳可将血清脂蛋白分出三条区带（α-脂蛋白、前β-脂蛋白和β-脂蛋白）。所以琼脂糖为较理想的凝胶电泳的一种材料。 血清中的脂类物质与载脂蛋白结合成水溶性的脂蛋白形式存在，各种脂蛋白中所含的载脂蛋白种类和数量不同、脂蛋白颗粒大小不同等因素，使它们在电场中的移动速率各异，因而可以通过电泳达到分离。;琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。;;（1） DNA的分子大小: 　　线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中蠕行，因而迁移得越慢。 （2） 琼脂糖浓度　　一个给定大小的线状DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。;;;4.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳：;将丙稀酰胺、甲叉双丙稀酰胺、缓冲液和催化剂等溶液按一定比例加到用琼脂封了底的玻璃管中，聚合后得到圆柱胶。实际操作时，在玻璃管中分两次灌胶。先灌下层的分离胶，待其聚合后再灌上层的浓缩胶。这样制得的凝胶柱实际上是个不连续体系。 利用该体系中凝胶孔径的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性，先使进入柱胶的样品在浓缩胶中逐渐浓缩、在上下胶层界面上最终被压缩成很薄的样品区带，进入分离胶后再进行组分的分离，形成最终的分离区带。 根据分离胶缓冲液pH值高低，有3种操作系统，分别为碱性系统、酸性系统和中性系统，其中以碱性系统最为常用。;;在浓缩胶中，除了有电荷效应和分子筛效应外，还存在一种特殊的浓缩效应。该效应是以上多种不连续效应综合作用的结果。这种不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳由于兼有电荷效应、浓缩效应和分子筛效应，因此具有很高的分辨率。其分子筛效应主要由凝胶孔径大小决定，而决定凝胶孔径的大小主要是凝胶的浓度。 但交联剂对电泳泳动率亦有影响，交联剂重量对总单位重量的百分比越大，则电泳泳动率越小。不管交联剂是以何种方式影响电泳时的泳动率，总之它是影响凝胶孔径的一个重要参数。 为了使实验的重复性较高，在制备凝胶时对交联剂的浓度、交联剂与丙稀酰胺的比例、催化剂的浓度、聚胶所需时间等影响泳动率的因子都应尽可能保持恒定。;如果合成的聚丙烯酰胺凝胶从上至下是一个正的线性梯度凝胶，点在凝胶顶部的样品在电场中向着凝胶浓度逐渐增高的方向即孔径逐渐减小的方向迁移。随着电泳