实验四肝脏DNA的提取.pptVIP

实验四 肝脏DNA的提取;核酸是具有重要生物化学功能的生物大子，最初从细胞核分离出来，又具有酸性，故称为核酸。 ;;DNA的一般提取步骤：;细胞的破碎 机械法 物理法 化学破碎方法 酶学破碎方法 ;细胞器的分离 在提取细胞线粒体和叶绿体DNA时，必须首先把线粒体和叶绿体与其它细胞器分离出来，一般采取在适当介质中的差速离心法分离。;DNA的提取 去除蛋白质：酚、氯仿 去除多糖、脂类：高盐 抑制DNase活性：去污剂，如SDS、CTAB DNA的沉淀：乙醇或异丙醇;DNA的纯化 有机溶剂抽提 柱层析法 梯度离心法 酶温和消化杂质等;DNA提取的几种方法：;苯酚抽提法 ?苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。 此法的特点是使提取的DNA保持天然状态。 ;实验目的：;实验原理：; 在提取时，通常采用0.14 mol/L的盐溶液来除去RNP，使DNP仍保持在沉淀中，然后使用浓盐溶液来提取DNP。 ;利用去污剂使与DNA结合的蛋白质变性，而与DNA分离，本实验使用的去污剂是SDS； 利用蛋白质不溶于氯仿-异丙醇 ，而DNA却溶解于其中的性质，将蛋白质除去； DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质则可以溶于酒精。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。 ;实验材料、试剂与器材：;2.器材 匀浆器或研钵研杆 移液枪 离心机 天平 恒温水浴箱 玻璃棒 解剖剪及镊子 50ml离心管等;离心前请两两离心管配平，对称放置。;⑴旋转拇指按钮设置吸取溶液的体积值，数字要完整地出现在显示窗中； ⑵ 套上枪头，旋紧； ⑶ 垂直持握可调式移液器用大拇指按至第一档； ⑷ 将枪头插入溶液，徐徐松开大拇指，使其复原； ⑸ 将可调式移液器移出液面，必要时可用纱布或滤纸拭去附于枪头表面的液体 ( 注意 : 不要接触枪头孔口 ) ； ⑹ 排放时，重新将大拇指按下，至第 — 档后，继续按至第二档以排空液体。 注意： 移取另一样???时，按卸尖按钮弃掉吸头并更换新吸头。 旋转按钮设置体积时，绝对不能超过每个移液器的最大值，扭过头。;1.将肝脏置于研钵中，捣碎，并加入5ml的溶液A。制成匀浆后，置于50ml离心管中，5000rpm离心8min。 2.弃上清，加入溶液A 4ml，然后滴加250g/L SDS溶液0.3ml，边加边用玻棒搅拌。 3.加完后，置于60℃水浴保温5min（不停搅拌），取出冷至室温。 4. 加入5mol/L NaCl溶液1.0ml，搅拌5min，加入约一倍体积氯仿：异丙醇=24：1混合液，即5.3ml，振摇5min，离心8min（5000r/min）。小心吸取上清液至一干净的50ml离心管中，记下体积，然后加入1.5倍体积95%乙醇，边加边用玻璃棒缓慢缠绕，DNA丝状物即缠在玻璃棒上。;5. 将DNA粗制品置于溶液B 2.7ml中，再加入溶液C 0.3ml，搅匀，加入1倍体积氯仿：异丙醇=24：1混合液即3ml，振摇5min，离心8min（5000r/min），取上清，加入1.5倍体积95%乙醇，DNA即沉淀析出。离心8min（5000r/min），弃上清，沉淀为粗DNA。 6. 将上步所得沉淀物溶于溶液B中，加入溶液D 0.3ml，搅匀。再加入氯仿：异丙醇=24：1混合液1.6ml，振摇，再加入1倍体积的95%乙醇，边加边搅，取出丝状物DNA。;注意事项：;思考与作业：