1植物基因克隆方法重点.ppt

植物基因克隆方法隋娜山东师范大学生命科学学院一、基因克隆（分子克隆molecularcloning）通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。二、基因克隆的核心---体外重组(Recombination)人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。载体DNA（vector）目的DNA（targetfragment）重组DNA（recombinantDNA）宿主（host）筛选、扩增克隆（clone）基因克隆的路线DNA重组转化用何种方法取决于基因产物（Geneproducts）的丰度以及gene的相关背景知识，如geneoritsprotein的表达模式及初级结构等（一）已知基因产物的基因分离（二）未知基因产物的基因分离（一）已知Geneproducts的基因分离1、利用DNA探针筛选基因文库前提是已知一段DNA序列并构建了基因文库●同源(homologous)DNA探针为了克隆一个完整基因结构或研究调节序列。●异源(Heterologous)DNA探针利用一种植物的一段DNA序列作探针，从其它植物中克隆同源基因注意：有的基因在不同物种间同源性很高，有的则很低。2、利用protein信息分离基因前提是所研究的protein可以从植物中分离纯化●利用antibody筛选表达文库(ExpressionLibrary)AntibodyproductionConstructionofExpressionLibrary●利用protein测序的氨基酸信息Probe(oligonucleotides)Primer(degeneratedprimer)RT-PCRandRACEPCRReverseTranscription,RapidAmplificationofcDNAEnds问题1：在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物。原因：1）RNA被降解建议解决方法：利用无污染技术分离RNA； 如果使用RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0。2）RNA中包含逆转录抑制剂建议解决方法： 通过乙醇沉淀RNA除去抑制剂。用70％（v/v）乙醇对RNA沉淀进行清洗。    逆转录抑制剂包括：SDS，EDTA，甘油，焦磷酸钠，甲酰胺和胍盐。    RT-PCR实验中的常见问题与对策3）多糖同RNA共沉淀建议解决方法：  使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖。4）起始RNA量不够建议解决方法：增加RNA量。 对于＜50ng的RNA样品，可以在第一链cDNA合成中使用0.1μg到0.5μg乙酰BSA。5）RNA模板二级结构太多建议解决方法： 将RNA和引物在不含盐及缓冲液条件下变性/退火.提高逆转录反应温度，对SuperScriptⅡ可以到50℃，对ThermoScript可以到65℃。    注意：不要在＞60℃时使用oligo(dT)引物，选择一个在反应温度可以退火的GSP。对于＞1kb的RT-PCR产物，保持反应温度≤65℃。 注意：不要在高于37℃时使用M-MLV。如果不需要全长cDNA，在第一链反应中使用随机引物。6）PCR引物设计较差建议解决方法：    避免在引物3‘端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。7）镁离子浓度太低建议解决方法：    从1mM到3mM，间隔0.5mM进行一系列反应，确定对于每个模板和引物对的最佳镁离子浓度。8）退火温度太高建议解决方法：  把退火温度设定为低于Tm5℃。因为公式估算Tm值比所有真正的退火温度实际会高些或低些。9）富含GC的模板建议解决方法：    对于GC含量＞50％的模板，使用PCRxEnhancerSolution。问题2：在琼脂糖凝胶分析中观察到非预期条带。原因：1）引物和模板非特异性退火建议解决方法：    以2℃到5℃间隔增加退火温度，减少退火时间。    在开始几个循环使用较高的退火温度，然后使用较低的退火温度。 使用PlatinumTaqDNA进行自动热启动PCR。2）引物设计较差避免在引物3‘端含有2到3个dG或dC。3）RNA中沾染了基因组DNA4）镁离子浓度太高建议解决方法： 优化镁离子浓度。5）因为扩增复杂模板导致引物错误起始建议解决方法：    使用巢式PCR或递减PCR。RACEPCRPCR和细胞内DNA复制的相同点：（1）两者都符合半保留复制模型，即两条链都可作为模板，子代链中一条链来自于亲代链，另一条链是新合成的（2）两者都需要引物（3）两者都需要依赖DNA的DNA聚合酶（4）两者的底物都是dNTP（5）DNA合成时都是在DNA聚合酶作用下按碱基配对原则往3’-OH上加dNTP，形成3’，5’磷酸二酯键（