DNA分离技术调研报告.pptVIP

第二讲 核酸提取技术 Part Two Techniques of Nucleic Acid Isolation;第一部分：DNA提取方法简介;　　　核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。 ;第一部分：DNA提取方法简介;;DNA提取的几种方法;DNA提取的几种方法;基因组DNA－ CTAB法;　CTAB提取缓冲液的经典配方;　CTAB提取缓冲液的改进配方;基因组DNA－ CTAB法;　CTAB法流程图;　CTAB法实例 1、1.5ml离心管中加入0.3ml提取液置65℃预热。 2、取材料0.03g，用液氮研磨（加入0.003gPVP及少许石英沙）迅速研磨成粉。 3、将冻粉迅速转入提取液中，尽快用移液枪混匀，在温度65℃水浴30min，期间轻轻摇动几次（防止DNA断裂）。 4、取出离心管，冷至室温，每管加等体积氯仿/异戊醇（24：1），轻轻混匀，颠倒混匀静止10min，10000rpm离心10min。 5、吸取上清夜于另一离心管中，加入1/10体积的3%CTAB，混匀；再加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），轻缓颠倒混匀，室温放置15min，然后10000rpm离心10min去上清。 6、分别用70%、80%酒精洗涤沉淀。在风扇下将沉淀吹干。;　CTAB法实例 7、加30μlTE缓冲液回溶DNA沉淀（不要反复吸打，用手指轻弹），同时加入终浓度50μl/mg RNase，置37℃处理1h。 8、加入等体积的氯仿/异戊醇 （24：1）抽提1-3次。 9、吸取上清，加入终浓度为0.2-0.4mol/l的NaCL，2倍体积的无水乙醇，放置1h左右，10、12000rpm 离心 10min 除去上清夜。 11、用70%乙醇洗涤沉淀2-3次，自然干燥后，溶于30μl去离子水中形成DNA提取液。 12、以DNA提取液/去离子水 1/100的比例加入石英杯中在蛋白质核酸分析仪中进行测定。; SDS法原理; SDS法流程图 （以动物组织为例） ; SDS法实例 1、取0.03g新鲜材料，置液氮中研磨成粉。 2、将冻粉转移置65℃预热的450μl DNA提取液中，轻轻晃动，使冻粉充分散开。 3、加入30μl 10%SDS充分混匀，置65℃水浴中保温10-15 min （间隔晃动2-3次） 4、加入48μl KAC充分混匀，冰浴中放置30 min 。 5、4℃ 12000rpm 离心15 min。 6、上清转入另一离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇（24：1），轻扣，倒离心管数次，放置片刻，于4℃8000rpm离心10min。 7、按6-7重复1-2次。 8、将上清转移另一离心管，加入2倍体积冷无水乙醇。轻缓摇匀，置-20℃沉淀0.5-1h。4℃ 10000rpm离心10min。 ;9、倒掉上清，用70%乙醇洗涤沉淀2-3次，吹干后，用30μl去TE缓冲液溶解沉淀。 10、DNA溶液加入RNase 1μl，于37℃保温0.5-1h。 11、用等体积的氯仿/异戊醇（24：1）抽提1-3次 12、70%乙醇洗涤沉淀2-3次，自然干燥后，溶于30μl 去离子水形成DNA提取液。 13、以DNA提取液/去离子水 1/100的比例加入石英杯中在蛋白质核酸分析仪中进行测定。 一步法: 1、0.03mg材料，加200μl 0.5mol/l NAOH研磨后，取60μl研磨液，加300μl 100mol/l Tris-HCL（PH 7.6）缓冲液中8000rpm离心5min，取上清即为DNA提取液。 2．以DNA提取液/去离子水 1/100的比例加入石英杯中在蛋白质核酸分析仪中进行测定。;基因组DNA－其它方法;基因组DNA－其它方法;基因组DNA－其它方法;质粒DNA－碱裂解法; 碱变性;质粒DNA－碱裂解法;;注意： 用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA)！！！;培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到1.5-3ml含有相应抗生素的液体培养基，37℃培养12～16小时; 取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100?l溶液1(GET) ，充分混匀放置3-5分钟; 加入200?l新配制的0.2mol/L NaOH+1％SDS（变性液），加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min;;加入150 ? l乙酸钾溶液(溶液II)，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5min; 用台式高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml 100％乙醇混匀，12000r/min离心