RNA酶保护试验试剂配制操作流程与注意事项.docVIP

RNA酶保护试验试剂配制、操作流程与注意事项 RNA酶保护试验 RNase Protection Assay,RPA 是通过液相杂交的方式，用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点： 1. 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。 2. 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。 3. 由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。 4. 步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。 5. RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。 6. 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。 7. 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。 RPA的缺点是需要同位素标记探针。 一、试剂准备 1. GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。 2. 杂交缓冲液：PIPES 0.134g、0.5M EDTA pH8.0 20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。 3. RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl pH7.4 20μl、0.5M EDTA pH8.0 20μl、RNase A 10mg/ml 8μl、RNase T1 250U/μl 1μl，加DEPC H2O至2ml 二、操作步骤 1.反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。 设计含T7启动子的PCR引物 由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7启动子序列： T7启动子序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG 引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性。 PCR 先用上游引物和下游引物进行PCR，再以PCR 产物为模板,用上游引物和下游引物-T7进行二次PCR 具体操作参见PCR章节 。 探针合成标记与纯化 在0.5ml 离心管中加入下列试剂： RNasin 40U/μl 0.5μl GACU POOL GAC 含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM 2μl [α-32P]UTP 10μCi/μl 2.5μlDTT 二硫苏糖醇，0.1M 1μl 5×转录 buffer 2μl 模板 50ng/μl 1μl T7 RNA 聚合酶 15U 1μl 混合后，短暂离心，37保温1hr。 加入DNase 10U/μl 1μl，37 15min，然后7510min以灭活DNAse和T7 RNA 聚合酶。 加入：饱和酚 50μl 氯仿 50μl 酵母tRNA 2μg/μl 4μl DEPC H2O 100μl 室温下充分混匀，离心10000g×2min。取上层液置另一0.5 ml离心管中，加入100μl氯仿，混匀，离心10000g×2min。将上层液转移至另一0.5ml 离心管中，再加入3M NaAc 10μl、预冷无水乙醇250μl，混匀后，-20静置30min。4离心13500g×10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗涤，4离心13500g×2min，弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀，4下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。 参见本节电泳步骤 。 2.杂交 RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1μg/μl。 取8μl RNA加入1-3μl探针 根据探针检测结果调整 于0.5ml 离心管中。 80℃保温2min，然后40-45下杂交12-18hr。 3. 消化 杂交管于37 保温15min，加入RNase消化液，37保温30min。 加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混匀，37保温10min。 加入65μl饱和酚和65μl氯仿，混匀，室温离心，10000g×2min。 转移上层液到另一0.5离心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl