第四章凝胶(排阻)20130321.pptVIP

第四章 凝胶（排阻）层析 中国医科大学实验技术中心 孙晋民 排阻层析(exclusion chromatography)，亦称分子筛层析(molecular sieve chromatography)、凝胶过滤(gelfiltration)。凡是利用生物大分子的相对分子质量(relativemolecular mass，Mr)差异进行层析分离的方法，均称之为排阻层析。用于排阻层析的分离介质称为排阻层析介质。在20世纪60年代初就开始使用凝胶介质分离生物大分子。例如，用淀粉或者琼脂糖作为电泳支持物分离血清中的蛋白质，凝胶在其中起分子筛作用。后来人们将凝胶制成球形微珠，作为液相层析分离介质，用于分离生物大分子，并获得巨大成功。现在使用的凝胶层析介质的用途远远超出了电泳分离介质的范畴，已成为分离纯化生物大分子最重要的分离介质之一，也是作为合成带有配基的层析介质应用最广泛的一种载体。凝胶层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通过特殊工艺合成的层析介质。目前已成为生物化学、分子生物学和生物制药在研究和生产中必不可少的分离介质。 第二节 凝胶层析原理 一、基本原理 凝胶类层析介质是一种在球体内部具有大孔网状结构凝胶微粒，不同大小的网状孔径像筛子一样，可以把大小不同的生物大分子按一定的顺序进行分离，好像“目数”不同的普通筛子一样把大小不同颗粒分级筛分。但是排阻层析与普通筛分的原理不同，排阻层析是按生物分子分子量的大小排序进行筛分的。 分子量小的分子由于能够进入凝胶内部的网状孔，沿着凝胶颗粒不同大小的网状孔流过，相对于大分子迁移的路径长，在柱内的停留时间长，保留值大，所以在层析过程中迁移率最慢，走在大分子的后面，后从柱中流出。 凝胶层析介质分离的分子主要分3部分。第一部分是全排阻分子，也可称之为上限分子量，不能起筛分作用的大分子。第二部分是部分渗透分子，称为分离分子，是凝胶介质有效分离的分子。第三部分是全渗透分子，称之为下限分子量，是不能起筛分作用的小分子。 二、参数的表示方法及其意义 1.柱床体积 凝胶层析介质经溶胀、装柱、沉降、体积稳定后，所占层析柱内的总体积，称为柱床体积或床体积，以Vt(total volume)表示，单位为ml。 2.外水体积 存在于柱床体积内凝胶颗粒之外、颗粒之间的空隙所占有的那一部分水相体积或溶剂体积，称之为外水体积或外体积，以Vo(outer volume)表示，单位为m1。 3.内水体积 是凝胶吸水溶胀后，存在于凝胶颗粒内所占有的那一部分水相体积或溶剂体积，称之为内水体积或内体积以Vi(inner volume)表示，单位为m1。 4.凝胶体积 是凝胶颗粒自身的体积，也就是床体积减去外水体积和内水体积后所占有的体积，称为胶体积或称干胶体积,以Vg(gel volume)表示，单位为m1。 三、参数之间的关系 测量法 1.床体积与Vo，Vi，Vg之间的关系式是： Vt=Vo+Vi+Vg (1-1) 2.洗脱体积与Vo，Vi的关系式为： Ve=Vo+KdVi (1-2) 式中Kd-样品组分在流动相和固定相之间的分配系数，也可以视为相对分子质量不同的溶质在凝胶颗粒的内部和外部的分配系数。它只与被分离物质相对分子质量的大小、凝胶颗粒空隙和网状孔径大小有关，与层析柱的长短和粗细无关。Kd可以通过实验获得。 3.Kd与体积之间的关系 可以将式(1-2)变换一下，即可得到Kd与体积之间的关系式：(1-3) Ve – Vo Vi 式中 Ve-实验测得的实际洗脱体积。 可用不被凝胶滞留的大的相对分子质量组分测得，通常用相对分子质量在2×106的蓝色葡聚糖-2000测定，可以通过干胶的吸水量(每克干胶所吸附水的毫升数)求得。对于一定条件的凝胶层析柱来说，只要通过实验得知某一组分的洗脱体积Ve，就可以计算出Kd值。 以上关系可以通过图2表示。 四、Kd的几种判断 在凝胶柱层析过程中，Kd可以有以下几种情况： 1.Kd=0时，Ve=Vo 对于完全不能进入凝胶内部的大分子(全排阻)，其洗脱体积就等于外水体积。 2.Kd=1时，Ve=Vo+Vi。对于完全可以进入凝胶内部的小分子(全渗透)，其洗脱体积就等于外水体积和内水体积之和。 由此可见，对于某一凝胶介质，如果在层析过程中有两种全排阻的大分子，即Kd=0，尽管它们在分子量之间的差别很大，但由于它们已经超出了该凝胶质的所能分离大分子的范畴，不可