siRNA干扰BMPRⅡ对肝癌细胞增殖和侵袭影响及VEGFC信号通路机制研究.pdf

第4章 讨论 摘 背景： BoneMorphogeneticProteins BMPs 骨形态发生蛋白 ， 属于转化生长因子 （TGF- ）家族成员，是一组能广泛参与调节多种细胞的增殖、分化和凋亡的功 能蛋白，在肿瘤的增殖、侵袭和转移中起重要作用。 骨形态发生蛋白 （BMPs）在肝癌的发生、发展中扮演着重要的角色。此前， 课题组已对BMPs众多亚型在肝癌细胞中的表达及功能和相关机制做了一系列 的研究:发现BMP-2、3、4、5、6、7及BMPR-II在肝癌中均有不成程度表达， 并发现BMP-2、6，尤其是BMP-2呈高表达，并且能够显著促进肝癌细胞的侵 BMPs BMPR 袭。 发挥其作用需通过其受体实现，但其受体 （ ）在肝癌中的作用 及其介导肝癌侵袭增殖的具体的机制尚不清楚。最近研究表明骨形态发生蛋白 受体II BMPR-II 是BMPs信号传导途径的关键调控因子，据此我们推测BMPR-II 对肝癌细胞增殖和侵袭可能有重要的作用。 肿瘤微环境在肿瘤的发生发展过程中占有重要的地位，肿瘤微血管生成与 肿瘤的侵袭增殖密切相关，血管生成因子是调控和促进肿瘤血管生成的关键因 素。VEGF-C作为主要的血管生成因子，可选择性地诱导淋巴管的增生,介导肿 瘤的血管生成和淋巴管的生长，与肿瘤侵袭和转移密切相关。BMPs可诱导各种 血管活性因子形成并刺激内皮细胞的迁移和新生血管的形成，我们的前期研究 显示血管生成因子MMP-2、MMP-9和E-钙粘蛋白在肝癌中呈不同程度的表达。 BMPR-II 的许多生理功能是通过信号通路途径实现。其中丝裂原活化蛋白 激酶 mitogen-activatedproteinkinase，MAPK 是细胞内重要的信号转导系统，我 ERK1/2 BMP-2 BMPs 们的前期研究显示 对 具有调节作用。但是 信号通路除了包 括ERK1/2信号通路，还包括P38和JNK信号通路。其具体的调控机制有待探究。 本研究拟在前期工作的基础上，采用细胞水平小片段RNA干扰技术沉默 BMPR-II基因，探讨BMPR-II对肝癌细胞增殖和侵袭的作用及并深层次分析研 II 万方数据 第4章 讨论 究BMPR-II参与调控所涉及到的相关信号传导途径及血管形成机制。本研究以 BMPR-II为切入点，揭示肝癌细胞增殖和侵袭的发生的分子机制；以VEGF-C 为目的，进一步细化肝癌侵袭增殖的血管侵犯机制；以信号通路为联系，阐明 肝癌侵袭增殖的调控机制。为肝癌的临床治疗探寻新的治疗靶点和思路。 目的： RNA干扰技术 RNAinterference,RNAi 抑制骨形态发生蛋白受体II bonemor -phogeneticproteinreceptor，BMPR-II 的表达，观察抑制BMPR-II后对人肝癌细 胞侵袭、增殖、凋亡和周期的影响及对VEGF-C相关的信号通路的影响。 方法： 1.通过半定量逆转录聚合酶链反应 RT-PCR 、蛋白印迹 （WesternBlot）技术 从肝癌细胞株HepG2、SMMC7721和Hep3B 中筛选BMPR-II基因高表达细胞 株。 2.设计并化学合成针对BMPR-II 的3对小干扰RNA smallinterferingRNA， siRNA ，采用阳离子脂质体法瞬间转染。采用离体培养肝癌细胞，并设Normal Control 组、Blank Control 组、Negative Control 组及 siRNA-BMPR-II-a 、 siRNA-BMPR-II-b、siRNA-BMPR-II-c转染组。 3.通过半定量逆转录聚合酶链反应 RT-PCR 和蛋白印迹（WesternBlot）法检 BMPR-II mRNA 测各组细胞中 在 和蛋白水平表达的变化，筛选沉默效果最佳序 列。 4.运用MTT 比色法及Transwell侵袭实验检测转染后细胞增殖及侵袭的变 化。流式细胞术检测转染后细胞凋亡和周期的变化。 5.运用MAPKs信号通路特异性抑制剂 SB203580 P38抑制剂 、PD98059 （ERK抑制剂）和SP6000（JNK抑制剂），分别观察阻断MAPKs各信号通路前、 阻断后及阻断加沉默BMPR-II后各相关蛋白的表达变化。 结果： 1.RT-PCR、Westernblot显示，在肝癌细胞HepG2、SMMC7721和Hep3B中， HepG2 BMPR-II 1.00±0.04 1.01±0.06P 0.01 细胞为 基因高表达细胞（ ， ）。 2.3个特异性siRNA-BMPR-II转染组分别转染24h和48h后，其BMPR-II的 mRNA 24h 和蛋白 48h 表达与另外3组比较受到明显抑制，结果显示 siRNA-BMPR-II-a 0.20±0.01,0.39±0.02