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进样阀 手动进样阀 自动进样阀 定子（Stator） 转子（Rotor） AKTA进样阀操作 手动进样注意事项 进样动作：Load状态时平缓推针，切换到Inject后再拔针以防倒吸 清洗：在Inject状态清洗进样口 对于Rheodyne进样器 一定要使用合规格的进样器，规格为外径0.028英寸，长2英寸的平头针。一定不能使用尖针，它会严重刮坏转子垫圈。 废液口：出口末端应与进针口水平以防倒吸或虹吸 进样阀操作注意事项 进样阀靠转子和定子的面密封，无法保证100%不泄露 缓冲液泄露会导致盐析出，损伤密封面和导流槽，严重时造成漏液和两个导流槽之间短路 实验完成后用纯水在load和inject状态下清洗，20%乙醇保存 使用完高盐溶液后用纯水冲洗 至少半个小时 定子（Stator） 转子（Rotor） 自动进样 进样动态范围广 样品残留少(连续洗针系统) 延迟体积少 进样重复性高( 0.5% RSD) 主要应用于分析型色谱 泵进料 针对料液中目标产物浓度极低，料液体积较大的情况（如用离子交换捕捉发酵液中表达量非常低的基因工程蛋白质）； 料液前处理非常重要，进料前必须用0.45 μm或更小孔径滤膜严格过滤； 进料过程必须密切注意压力变化； 推荐使用蠕动泵进料。 柱切换进料 解决下列问题 人工换柱带来的泄漏和污染 周期长导致蛋白质失活 通量低和收率低 多柱组合层析 多柱组合层析纯化蛋白质实例 白蛋白、AT-Ⅲ、运铁蛋白均达到了电泳纯（纯度≥99%） α1-AT和结合珠蛋白（两个条带）的纯度也在95%以上 整个过程用时140分钟 采用收集洗脱峰，人工换柱层析，则至少需要3天 5 检测系统 光学检测器（如紫外-可见、荧光、示差折光、蒸发光散射、多角度激光散射等） 热学检测器（如吸附热等） 电化学检测器（如pH、极谱、库仑、安培等） 电学检测器（如电导等） 古老的方法：目测、离线显色反应 目测法 色谱名称的由来 最古老原始的方法 在玻璃柱中观察带颜色物质形成的条带 石油醚 碳酸钙颗粒 色素 色谱 组分 显色反应 没有在线检测器 针对一些没有紫外吸收的物质，如多糖，PEG等 设备要求低 工作量大 紫外-可见检测器 主要组成部分 光源 分光系统 样品池 光强探测器 分类 固定波长检测器 可变波长检测器 单波长检测器 多波长检测器 二极管阵列检测器 纵坐标为吸光度A，横坐标为时间作出的曲线即为层析图谱 固定波长紫外检测器 汞灯光谱图 滤光片原理示意图 固定波长紫外检测器 Pharmacia UV Monitor UV-1 AKTA PRIME和UPC所配检测器 国产8823B 汞灯为光源，荧光片和滤光片来选择波长，通常为254和280nm，分别用于核酸和蛋白的监测 结构简单，价格较便宜 可配套国产色谱工作站（如N2000）进行数据采集 可变波长紫外-可见检测器 氘灯光谱图 钨灯光谱图 氘钨双光源光谱图 AKTA检测器 氙灯光谱图 氙灯作为光源 优点：全波长、光强高 缺点：脉冲灯，每次闪耀光强不一样 二极管阵列和CCD检测器 紫外检测器光源 一台AKTA 开灯后，每小时光源烧掉10元，如果加上光栅的损耗（60,000 元/3000 hr），每小时耗费30元，一天（8小时）为240元，一个月（20天）为4800元； 为节省操作费用，必须注意： 装填、平衡或者冲洗层析柱时不需要开灯； 完成实验后冲洗系统前把紫外灯关闭； AKTA紫外可见检测器操作注意事项 汞灯、氘灯、钨灯使用寿命和点燃次数相关 氙灯寿命与使用时间有关，和点燃次数无关 因此，在不必要的时候，例如装填、平衡或者冲洗层析柱时随手关灯 多波长检测时，光栅一直处于旋转状态，两个波长差别越大，旋转角度越大，影响寿命 因此，如无特殊需要，最好使用单波长检测 6.维护——每天 系统 ◇ 清洁擦拭外表，防止试剂或结晶的盐腐蚀设备 ◇ 溶液和样品必须过滤 ◇ 检查系统管路和接头有无破损，系统是否渗漏。 ◇ 使用完毕，须用水将系统冲洗干净，之后用20%乙醇清洗系并保存所有的流路。 pH计 ◇ 使用前校正pH计。 ◇ 用后将pH计拆下放入保护液（1:1 pH 4 buffer和 2 M KNO3，或pH4.0的饱和KCl溶液）。 泵 ◇检查泵头周围是否渗漏，如果泵头有渗漏,或是流量不准确，则需更换泵头密封圈。 ◇更换缓冲液时，需排尽泵头里的残存气泡，否则会影响流速的准确性。 Open 维护——每周 在线滤器 清洗过滤片，如有必要须更换过滤片，否 则会形成很高的在线压力，流速降低。 ON-LINE FILTER change P-901(100ml/min) High Flow LC Filter Polymer Support P-903 (10 ml