蛋白质的修饰和表达03解决方案.ppt

第三章 蛋白质的修饰和表达 主要内容 第一节 蛋白质修饰的化学途径(P88-94 自学) 第二节 蛋白质改造的分子生物学途径 第三节 重组蛋白质的表达 第二节 蛋白质改造的分子生物学途径 基因突变技术是通过在基因水平上对其编码的蛋白质分子进行改造，在其表达后用来研究蛋白质结构功能的一种方法。 分类： 位点特异性突变 基因突变技术 （按特点划分） 随机突变 1)通过寡核苷酸介导的基因突变 位点特异性突变 2)盒式突变或片段取代突变 3)以双链DNA为模板，利用PCR 技术进行的基因突变 可以这样说，PCR技术的出现为基因的突变，基因的剪接开辟了一条极其有效、极其快捷的道路。当然无论哪种方法都可以在为蛋白质编码的基因序列上产生插入、缺失、取代等突变。 1．编码基因的专一性位点突变 定义：专一性位点突变又称特异性位点突变。这类突变都是在含有突变序列的寡核苷引物介导下进行的，因此又称为寡核苷酸介导的位点特异性突变。这种突变的方法从问世至今不断更新，特别是PCR技术出现后变得更高效。 (1) 寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 (2) 几种寡核苷酸介导的基因突变方法 (1) 寡核苷酸介导的基因突变中的各种因素 DNA模板的制备 对于单链DNA模板一定要高纯度，即使少量的RNA分子都会影响突变的特异性。 ② 核甘酸突变引物的设计和选择 必须与模板链上的目标DNA序列有必要的互补区 足够长，以便与目标DNA序列退火 突变引物应尽可能避免形成稳定的二级结构的回文序列、重复序列或自身互补序列 突变引物要特异，不能与目标DNA中突变位置以外的DNA形成非特异性的杂交混合体 ③核甘酸突变引物与模板DNA的退火和引物延伸条件 对于突变引物与模板DNA的比率 一般是双引物与模板之间的摩尔比在10～50：1之间。 退火保证引物与模板形成稳定的杂交体。 原则：退火温度为理论预测的Tm值以上20℃，然后再慢慢冷却至较低温度，形成双链。 引物延伸 加入延伸所需的dNTP、ATP、DNA聚合酶、DNA连接酶等。在适当温度下进行2—15h的连接。 ④DNA聚合酶的选择 T4DNA聚合酶 T7DNA聚合酶 Klenow酶 在单引物的延伸反应中，避免使用不当的酶引起引物置换，导致突变效率降低。 ⑤dNTP（脱氧核苷三磷酸）对立体DNA合成的影响 dNTP纯度要高 dCTP氧化脱氨可以产生微量dUTP，当多核苷酸中搀入UMP时，受体菌中的尿嘧啶-N-糖基化酶可在U的位置切断DNA链，而细胞内的DNA聚合酶能够产生切口平移，从而降低突变体的产率。 ⑥受体细胞对突变体产率的影响 大肠杆菌细胞内的几个错配修复系统 解决方案：采用错配修复系统缺失的系统菌株作为受体菌。 当用M13作为克隆载体时，M13可能会出现不对称复制，如果突变链复制率较低就影响试验结果 (2) 几种寡核苷酸介导的基因突变方法 ① Kunkel 突变法 ② 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 ③ 基于去除特定限制酶切位点的突变 ④ 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变 ① Kunkel 突变法 具体步骤： ② 基于抗生素抗性“回复”的突变方法 ③ 基于去除特定限制酶切位点的突变 ④ 利用聚合酶链反应(PCR)产生定点突变 取代突变 插入突变 缺失突变 2．区域性定向突变 基因工程技术不但可使基因产生特异性位点突变，也可以产生区域性的突变。 常用的方法如盒式突变法(cassette mutagenesis)，又称片段取代法(DNA fragment replacement)。 这一方法的要点是利用目标基因中所具有的适当的限制性内切酶位点，用具有任何长度、任何序列(或任何混合序列)的DNA片段来置换或取代目标基因上的一段DNA序列。 研究目的 通过改变几个氨基酸序列来研究蛋白质的结构-功能之间的关系，也可以通过盒式突变法产生嵌合蛋白质。在这个嵌合蛋白质中，蛋白质分子中的整个结构域都可以用完全不同的氨基酸序列来置换。 盒式突变最主要的用途是产生各种特异性的突变或突变家族，在这些突变体中各种不同的序列被集中在目标基因的一个特定区域，从而为研究蛋白质特定结构区段或特定结构域的结构和功能提供了一个切实可行的方法。 二、基因融合和基因剪接 1．利用基因融合技术表达外源基因的缘由 2．基因融合的策略与蛋白质分