第7章 重组DNA药物课件.pptVIP

第七章 重组DNA药物 一、重组DNA技术与基因工程的基本定义 重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。 因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。 基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。 上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。 优点： 1、可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽；去除内源性物质的不足之处 2、提供足够数量的生理活性物质，以进行生理生化、结构的研究 3、利用基因工程技术可发现、挖掘更多内源性生理活性物质 4、获得新型化合物 主要基因工程产品的研制、开发、上市时间 产品 人生长激素释放抑制素（SRM) 人胰岛素 首次克隆 表达时间 国家 用途 首次进入 市场时间 国家/地区 1977 日本 治疗巨人症 1978 美国 治疗糖尿病 1982 欧洲 人生长激素（HGH) 1979 美国 治疗侏儒症 1985 美国 人α干扰素（ α－IFN) 1980 美国 治疗病毒感染症 1985 美国 乙肝疫苗 1983 美国 预防乙型肝炎 1986 欧洲 人白细胞介素－2 1984 日本 治疗肿瘤 1989 欧洲 人促红细胞生成素 治疗贫血 1988 欧洲 人粒细胞集落刺激因子 治疗中性白细胞减少症 1991 美国 人组织纤溶酶原激活剂（t-PA) 治疗血栓症 1987 美国 DNA重组药物制造的主要步骤 获得目的基因 DNA的体外重组（切与连） 载体的选择 受体细胞的选择 重组DNA分子转化 （转） 转化子的筛选与鉴定（选） 外源基因的大规模表达和分离纯化 产品的检验和制剂制备 二、基本过程 上游阶段： 实验室 获得目的基因、酶切和酶连、插入适当载体、转入宿主细胞、复制、目的基因分析确证、表达、筛选合适表达系统等 下游阶段：将实验室成果产业化 发酵参数确定、新型生物反应器研制、高效分离介质及装置开发、生物传感器设计制造、电子计算机优化控制、产品质量控制 注意：上游DNA重组的设计必须以简化下游操作工艺和装备为指导思想；而下游过程则是上游基因重组蓝图的体现和保证，这是基因工程产业化的基本原则。 1、目的基因的获得 1）、鸟枪法（基因文库） 基因组DNA提取→ 限制性内切酶部分水解→与载体连接→转化、扩增与筛选 2）、逆转录法（cDNA文库） mRNA纯化→cDNA第一合成→第二链合成→ cDNA克隆→将重组体导入宿主细胞→ cDNA文库鉴定→目的cDNA克隆的分离和鉴定 3）、合成法 4）、PCR法 4、PCR法或逆转录PCR（RT-PCR） 典型PCR反应包括 ①模板变性 94℃以上（1～2′） ②退火 50～55℃（1～2′） ③延伸 72℃（1～2′） 在高温聚合酶作用下， 以DNA单链为模板， 由引物起始从5′→3′ 延伸。 PCR用于基因突变 化学合成法 在已知DNA序列或多肽的一般结构时，如链长在 60bp～100bp可用化学合成法直接合成DNA。 2、基因表达 1）、选择宿主细胞 原核 大肠杆菌：生长快；遗传研究深入；产品多为胞内（包含体）或周质中；不能糖基化修饰。需注意内毒素污染。 枯草芽孢杆菌： 分泌力强，不形成包含体；不修饰；胞外酶可能会降解产物 链霉菌：分泌能力强；不致病，安全；有糖基化能力。 优点：易大量生产，成本低，周期短 缺点：多为胞内表达、提取困难，易生成包含体、含起始密码Met(AUG)，有内毒素毒性 真核 酵母：研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物；基因组小，仅为大肠杆菌4倍；传代时间短；无毒；有分泌功能和修饰功能；已用于干扰素、乙肝表面抗原等重组DNA药物的生产。 丝状真菌：有很强的蛋白质分泌能力，能正确加工，糖基化方式与高等生物相似，有成熟发酵和后处理工艺 哺乳动物细胞：类似天然产物，但培养条件苛刻 大肠杆菌与真核细胞表达系统比较 大肠杆菌: 发酵 包含体 复性 纯化 目的蛋白 真核细胞: 发酵 上清液 纯化 目的蛋白 大肠杆菌表达的重组蛋白易形成包含体 高效表达的目的蛋白 在大肠杆菌内形成大 量无活性包含体。 因无法有效的解决复 性问题，在美国每年 造成的经济损失就达