第四章 抗体制药part3课件.pptVIP

第五节 抗体工程 一、1890年Behring发现白喉抗毒素为代表，其特点 是用抗原免疫动物来获得多克隆抗体 二、以1975年Kohler创建杂交瘤技术制备单克隆抗 体为代表。 三、以1994年Winter以基因工程方法制备抗体为代 表 四、1994年Winter创建了噬菌体抗体库技术 第五节 抗体工程 抗体分类 多克隆抗体 免疫动物 单克隆抗体 杂交瘤技术 基因工程抗体 噬菌体抗体库技术 第五节 抗体工程 一、噬菌体抗体库技术的基本方法 二、噬菌体抗体库技术的特点 三、基因工程抗体的表达 第五节 抗体工程 1.获取目的基因 一般都是从提取RNA经反转录PCR获取抗体某一特定基因区段，如重链和轻链可变区（VH、VL）基因。抗体基因的组合形式多为单链抗体。 第五节 抗体工程 2.抗体库技术的载体 现在普遍使用的噬菌粒（phagemid）载 体，具有噬菌体和质粒的共同特点。抗体蛋白和噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式表达在载体表面，再感染后，能使目的克隆得以扩增。 第五节 抗体工程 3.淘筛 淘筛的基本过程是：抗原固相化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后在感染扩增 ，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库 ，在反复与抗原吸附，经几轮淘筛后，淘汰了非目的克隆，是目的克隆大量地扩增。 第五节 抗体工程 4.表达与鉴定 目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌株，进行可溶性表达，其产物用Western blot分析确定后，完成全过程。 第五节 抗体工程 遗传工程鼠 人抗体鼠：将小鼠lg基因灭活，然后转入人lg基因，生产出人单抗 第五节 抗体工程 噬菌体抗体库技术 将抗体全套可变区间基因组装到噬菌体载体，并 表达于噬菌体表面，所得到的多样性噬菌体抗体的集 合，称为噬菌体抗体库。 利用噬菌体抗体库，筛选并富集特异性抗体的过 程，称为噬菌体抗体库技术。 第五节 抗体工程 噬菌体抗体库的分类 ㈠ 按抗体基因的性质分 1. DNA 文库 2. cDNA 文库 ㈡ 按抗体基因的来源分 1. 天然抗体库（native antibodu library） 2. 免疫抗体库 3. 半合成抗体库 4. 全合成抗体库 第五节 抗体工程 噬菌体展示技术的原理 第五节 抗体工程 噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融合蛋白的形式表达并展示在噬菌体表面，同时将其遗传密码包含于噬菌体内部，这使得蛋白质的功能与其基因密码有机的连接在一起。 第五节 抗体工程 选择方式： 淘选（Panning） 而不是 筛选（Screening） 第五节 抗体工程 第五节 抗体工程 第五节 抗体工程 第五节 抗体工程 第五节 抗体工程 第五节 抗体工程 第五节 抗体工程 第五节 抗体工程 第五节 抗体工程 一、噬菌体抗菌库的构建 第五节 抗体工程 第五节 抗体工程 第五节 抗体工程 筛选流程 第五节 抗体工程 第五节 抗体工程 二、噬菌体抗体库技术的特点 基因型和表型相统一 选择能力和扩增能力相结合 第五节 抗体工程 噬菌体展示技术最关键的优势有三： 第一，淘选的高效率使得在极低的存在水平下，挑选 到高亲和力噬菌体成为可能； 第二，所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通 过感染细菌得到富集； 第三，展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的 基因密码的连接，使得结合肽或蛋白质的序列分析既 快速又简便。 第五节 抗体工程 噬菌体抗体库技术的优势 可实现单抗的小型化 可实现单抗的多功能化 简单易行、生产成本低、筛选容量大、 可通过发酵生产、大量制备 单克隆抗体 噬菌体抗体 杂交瘤技术 展示技术 宿主细胞 杂交瘤 细菌 筛选范围 ~103 107~109 时间 几个月 几周 操作 繁杂 相对简单 免疫 必须 可避免 人源抗体 — + 费用 高 低 生产量 有限 无限 基因获取 再克隆 直接 应用前景 有限 不可估 第五节 抗体工程 第五节 抗体工程 三、基因工程呢抗体的表达 原核表达 大肠杆菌 真核细胞表达 哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母 转基因植物表达 转基因动物表达 第五节 抗体工程 抗体在体外人源化存在的问题 操作过程复杂 需付出昂贵