大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒的转化要点.pptxVIP

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2016-08-04 发布于湖北
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大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒的转化要点.pptx

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感受态的制备和质粒的转化组员：陈彦梅杨琳马转转材料及方法 CaCl2法制备感受态的原理感受态细胞的制备质粒的转化转化子的筛选材料及方法菌种：大肠杆菌BL21菌株质粒：pGEX-6P-1 感受态制备方法：CaCl2法转化方法：热激法 CaCl2制备感受态的原理: 细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物。感受态的制备受体菌的培养第一次活化(12h) 第二次活化(12h) 试管培养(12h) 摇瓶培养(OD6000.3-0.4) 离心弃上清离心弃上清离心弃上清分装，-80℃保藏 0.1M，1/4 0.1M,1/20+9/20 每50ml加1ml 感受态细胞的制备质粒的转化质粒2μl 感受态细胞 200μl 冰浴30min，42℃热激90s，冰浴2min 涂LBA培养基，37℃，12h 转化子的筛选无抗平板+感受态抗Amp平板+感受态+质粒抗Amp平板+感受态长满长满未长转化率转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此平板中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积转化频率（转化子数/每ug质粒DNA）＝转化子总数/质粒DNA加入量（ug）转化子总数＝N×1×200/200＝N 转化频率＝N/10-4（0.1 ng=10-4?ug）＝N×104`