蛋白纯化层析技术和工艺放大要点.ppt

蛋白质层析技术和工艺放大 曹杰 2013.05.11 一、离子交换层析技术 二、亲和层析技术 三、切向流过滤技术 四、工艺放大 一、 阴离子交换 阳离子交换 分辨率: 1 选择性: 填料的性质及所带功能基团的数目、pH值、离子强度、洗脱条件 2 柱效： 填料颗粒大小、层析柱装填效果 3 样品： 能应用的样品量即样品各成分性质 二、 亲和层析原理 亲和层析的策略 配基与目标蛋白的特异性 尽可能简单 设计洗脱方案 抗体纯化 ——基于G蛋白/A蛋白的IgG的纯化 1. LMW Markers 2. Mouse cell culture, nonredued,diluted 1:10 3. PoolⅠ,unbound material,nonredued,diluted 1:10 4. PoolⅡ,purified mouseIgG1, nonredued,diluted 1:10 如何除去特定的污染物 三、 切向流过滤技术 膜过滤原理 膜过滤技术，又称膜分离技术，是使用一定孔径的过滤介质将不同物质按照大小和形状进行选择性分级分离的物理分离方法。 膜过滤技术的优点 （1）快速高效、低能耗、硬件设备简单易于维护； （2）易于实现全自动化操作和线性放大 （3）膜分离操作条件温和、不涉及相变，有利于保持生物活性分子的结构和稳定性。 过滤技术的分类 按照滤膜孔径范围可以分为常规过滤、微滤、超滤和反渗透等 过滤技术的分类 按照过滤操作方式分： 死端过滤( Normal Flow Filtration , NFF ) 切向流过滤( Cross -flow Filtration, CFF) 切向流过滤 切向流过滤又称错流过滤，过滤过程中平行于膜的切向流不断清洗冲刷膜表面，有效的缓解膜表面滤饼层和浓差极化层的形成，避免过滤阻力的快速增加，有利于保持稳定的过滤流速和压力，从而实现更高的膜过滤处理量，延长滤膜寿命 根据滤膜流道结构形式又可分为中空纤维柱和平板膜包 过滤技术的选择 膜孔径选择 过滤操作方式选择 切向流过滤技术选择 膜孔径选择 (1)如希望目标物质透过膜孔，一般选择膜孔径大小为目标物质直径5 - 10倍以上以降低过滤阻力，提高通透性：例如重组抗体纯化中，CHO 细胞培养液的柱前澄清，建议使用0.2 或0.45 μ m 中空纤维微滤膜，可以保持单抗分子( 150 kDa ) 良好的膜通透性，实现高收率。 膜孔径选择 (2) 如希望目标物质充分截留，一般需选择膜孔径小于目标物质直径1/3 – 1/5 ：例如抗体150k的浓缩和缓冲液置换，一般选择30k或50k超滤膜实现充分截留. (3) 超滤膜用于细胞收集速度更快，操作更简单：例如中空纤维750k超滤膜用于大肠杆菌或昆虫细胞快速收集，取代离心机。 （4）微滤膜用于蛋白澄清去除细胞碎片具有更好的目标蛋白收率：例如中空纤维0.1μm滤膜用于较难过滤的大肠杆菌裂解液澄清，保护层析柱。 过滤操作方式选择 过滤常见的操作方式包括NFF死端过滤和CFF切向流过滤 切向流过滤技术的选择 中空纤维柱和平板膜包的优缺点： 切向流过滤技术的选择 中空纤维滤膜具有开放式流道(Open Channel ) ，剪切力低且容尘量高，适合病毒和蛋白等生物大分子低剪切力的温和超滤浓缩、可直接处理高固含量高黏度的复杂料液，如细胞菌体收集、裂解液澄清和硫酸铵沉淀收集等应用。 平板膜包的筛网流道结构( Screen Channel ) ，适合无固体颗粒的低黏度低浓度样品的浓缩，如层析柱之间的缓冲液交换和浓缩等。 切向流过滤技术的选择 中空纤维滤膜可以用于微滤或超滤，用于蛋白/ 病毒等浓缩洗滤或直接处理高固含量料液； 而平板膜包常用于澄清料液的超滤浓缩，对于高固含量高黏度样品的澄清过滤存在较大局限性，易于堵塞流道。 四、 Process Scale up 工艺放大 菌种的特性，相关论文、专利，药典，试剂等 亲和层析、离子层析、疏水层析、分子筛、超滤，层析介质粒径大小，纯化步骤等 载体构建优化、发酵工艺优化、纯化工艺优化、检测方法选择等 发酵工艺是否能够放大、纯化工艺是否能放大等，工艺稳定性 环境安全性：废气废液排放，菌种的处理，选择有关试剂的替代品 知识产权的保护，专利什么时候到期？ Regulatory requirements 了解相关法律、法规、验证计划、QA和QC等 如何保证质量？确定分析方法、检测方法、如何保证工艺稳定性。 工艺放大（以蛋白纯化为例） 要考虑的问题： （1）样品、试剂：样品来源（原核或真核、胞内或胞外等），目标蛋白的性质（等电点、分子量、稳定性等），缓冲液（pH