第五章+凝胶过滤.ppt

第五章 凝胶过滤 是20世纪60年代发展起来的一种分离纯化方法。 又叫分子筛层析—凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排阻在外部。当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开。 不同类型凝胶的筛孔的大小不同 凝胶过滤基本原理 相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快，所以首先流出。 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程较长，移动速率慢，所以最后流出。 中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。 样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 凝胶过滤层析过程示意图 凝胶过滤的优点： 设备简单 操作方便 重复性好 样品回收率高等特点 适用： a.分离纯化蛋白质（包括酶类）、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物质 b.测定蛋白质的分子量 c.样品的浓缩和脱盐等方面 第一节 凝胶的分类及性质 性质： 凝胶不溶于水，但在水中有较大的膨胀度和较好的分子筛功能。 分类 葡聚糖凝胶（Sephadex） 天然琼脂糖（Sepharose、Bio-gel A） 交联琼脂糖（Sepharose CL-） 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel） 交联葡聚糖 双丙烯酰胺共聚凝胶（Sephacry1） 交联葡聚糖与葡聚糖共价结合的凝胶（Superdex） 一、 葡聚糖凝胶 商品名：Sephadex，由葡聚糖（右旋糖酐）（G型）和3-氯-1，2-环氧丙烷（交联剂）以醚链相互交联而成的。在交联葡聚糖G-25和G-50中分别加入羟丙基基团反应，即可构成LH型烷基化葡聚糖凝胶。 1．理化性质 葡聚糖凝胶：白色珠状颗粒，在显微镜下可见其表面的网状皱纹。含大量羟基，亲水性好，在水溶液或电解质溶液中极易膨胀。不同型号的葡聚糖凝胶的交联度不同，膨胀度、吸水量、筛孔的大小和分组范围有明显的差异。 1）以G型葡聚糖凝胶作为固定相，以水溶液作为流动相，对水溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶过滤层析。 2）以LH型葡聚糖凝胶作为固定相，以有机溶剂为流动相，对脂溶性物质进行分离的层析方法称为葡聚糖凝胶渗透层析。 2．稳定性 葡聚糖凝胶在水溶液、盐溶液、碱溶液、弱酸溶液和有机溶剂中稳定，不溶解，很少产生化学降解。 在中性条件下，葡聚糖凝胶悬浮液可高温（120℃）消毒30分钟，性质不变。在0.1mol/L HCl 溶液中浸泡1-2小时，在0.02mol/L HCl 溶液中浸泡6个月以上，对分离效果无明显的影响。 当暴露于强酸或氧化剂溶液时，易使糖苷键水解断裂。 葡聚糖凝胶欲在室温下长期保存时，应加入适量的防腐剂如氯仿、叠氮化钠等。否则，微生物将生长。 3．吸附性 葡聚糖凝胶系弱酸性物质，因为含羧基基团。该基团能与分离物中电荷基团（碱性蛋白质）发生吸附作用，可提高洗脱液的离子强度。但当离子强度大于0.05时，对弱碱性蛋白质就无吸附力了。葡聚糖凝胶层析时，用含有 NaCl 的缓冲液作洗脱液。 二、琼脂糖凝胶 琼脂糖是由D-半乳糖和3、6脱水的L-半乳糖连接构成的多糖链，在100℃时呈液态，当温度在45℃以下时，以氢键方式相互连接成线性的双链单环的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。 对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力，在pH 4.0-9.0的缓冲液中是稳定的。 琼脂糖的商品名称是因生产厂家不同而异：瑞典称 Sepharose美国称 Bio-gel A英国称 Segavac丹麦称 Gelarose我国的同类产品与瑞典相同，这些琼脂糖中除Segavac外，都是以珠状琼脂糖凝胶形式出售。 琼脂糖凝胶按其浓度分：Sepharose 2B（2％浓度）、4B（4％）和6B（6％）。Sepharose 6B的机械强度大于2B，但是筛孔小于2B。 琼脂糖凝胶在干燥状态下易破裂，一般存放在含防腐剂的水溶液中，避免剧烈的搅动。 CL型交联琼脂糖：Sepharose 与1, 3-二溴异丙醇（1, 3-dibromopropanol）在强碱性条件生成的。 优点： 其筛孔与同浓度的、未交联的琼脂糖相同，热稳定性与化学稳定性好 可在广范围的pH溶液（pH3-14）中使用，用较强的碱溶液短时间处理，性能不会改变。 缺点：在氧化剂存在下，会有少量的多糖链发生解聚。 琼脂糖凝胶的机械强度和筛孔的稳定性都比葡聚糖凝胶好，用琼脂糖凝胶进行柱层析时，流速可以快些。 三、聚丙烯酰胺凝胶 商品名Bio-gel。是以甲叉双丙烯酰胺（双体）