蛋白质纯化技术(上)要点.pptVIP

A Brief View of Protein Purification ? 蛋白质的分离纯化是研究蛋白质结构、化学组成和生物功能的基础。蛋白质在自然界中存在于复杂的混合体系中，而且许多重要的蛋白质在细胞中的含量极低。 要把蛋白质从复杂的体系中分离出来，同时又要防止其组成、结构的改变和生物活性的丧失，显然是有相当难度的。 浓缩 保存状态 保存条件 保存期限 …… 动物 植物 培养物 材料的收集 ?过滤 ?离心 颗粒化处理 ?剪切 ?研磨 离 心 ? A 19th century hand cranked laboratory centrifuge. 离心是利用离心力，分离液体与固体颗粒或液体与液体的混合物中各组分的方法。  粒子在离心场中的运动速度： 离心加速度： 离心分离因数： Fr≤3500 常速离心 Fr=3500~50000 高速离心 Fr50000 超速离心 rpm与g的换算 （r,旋转半径，cm; N，转速，rpm） 沉降系数 每单位离心场的速度 1S=10-13s 机械方法 非机械方法 搅拌、振动 研磨 压滤 超声 匀浆 干燥 渗透压 冻融 酶 超声破碎 频率高于20000HZ的声波称为“超声波”。 超声破碎的原理——空化作用 当超声波在液体中传播时，由于液体微粒的剧烈振动，会在液体内部产生小空洞。这些小空洞迅速胀大和闭合，会使液体微粒之间发生猛烈的撞击作用，从而产生几千到上万个大气压的压强。微粒间这种剧烈的相互作用，会使液体的温度骤然升高，起到了很好的搅拌作用，从而使两种不相溶的液体（如水和油）发生乳化，并且加速溶质的溶解，加速化学反应。这种由超声波作用在液体中所引起的各种效应称为超声波的空化作用。 超声破碎 影响超声破碎的因素 -超声波强度：对于一般液体超声波强度增加时，空化强度增大，但达到一定值后，空化趋于饱和。 -超声波振幅：振幅越大，效率越高。 -超声波频率：频率越低，在液体中产生空化越容易 。 -液体的表面张力与黏滞系数：液体的表面张力越大，越不易于产生空化 ，黏滞系数大的液体难以产生空化泡 。 -液体的温度：液体温度越高，对空化的产生越有利，但是温度过高时，气泡中蒸汽压增大，因此气泡闭合时增强了缓冲作用而使空化减弱。-探头的材料与形状 功率恒定时，探头的振幅与面积成反比。钛是最好的探头材料。 -处理量 大体积的处理对象需要更大的功率。 超声破碎 利用超声波进行细胞破碎时，体系中会产生自由基，它可能破坏蛋白的结构，因此进行超声破碎之前，需可以添加自由基清除剂，如还原型的GSH，也可以用氢气预吹细胞悬浮液来缓和。 渗透压 溶液渗透压，简单的说，是指溶液中溶质微粒对水的吸引力。溶液渗透压的大小取决于单位体积溶液中溶质微粒的数目：溶质微粒越多，即溶液浓度越高，对水的吸引力越大，溶液渗透压越高；反过来，溶质微粒越少，渗透压就低。渗透压与无机盐、蛋白质的含量有关。在组成细胞外液的各种无机盐离子中，含量上占有明显优势的是Na+和Cl-，细胞外液渗透压的90%以上来源于Na+和Cl-。 渗透压 渗透压 直接低渗溶液处理 化学渗透 有机溶剂 （Benzene 、Methylbenzene ） 抗生素（Penicillin ） 表面活性剂 （Triton) 金属螯合剂 (EDTA) 变性剂(Urea) 改变细胞壁或者细胞膜通透性 酶破碎法 ? 为了方便提取与分离目的蛋白，通常需要把所有的蛋白（目的蛋白和杂蛋白）都溶解在同一体系中，然后再根据它们在液相中的不同性质而将它们进行分离与纯化。 清蛋白 可溶于稀盐、稀酸、稀碱。 可被饱和硫酸铵沉淀。 eg:白蛋白，卵清蛋白 球蛋白 不溶于水但溶于稀盐，可以被 半饱和的硫酸铵沉淀。 eg: IgG，肌球蛋白 谷蛋白 不溶于水、醇和中性盐溶液， 但溶于稀酸或稀碱。 eg:米谷蛋白 谷醇溶蛋白 不溶于水及无水乙醇，但溶于 70-80%乙醇中。非极性侧链多 eg:小麦醇溶蛋白 组蛋白 溶于水和稀酸，但可被稀氨水 沉淀，分子中含His、Lys多。 eg:小牛胸腺组蛋白 鱼精蛋白 溶于水及稀酸，不溶于氨水， 分子呈碱性。 eg:鲑精蛋白 硬蛋白 不溶于水、稀酸、稀碱、盐。 有较强机械强度。 eg:角蛋白，胶原 面对的问题 ?杂质的去除 ?蛋白的稳定 ?溶解体系与条件 杂质的去除 脂类： 离心：吸去浮在表面的脂类； SiO2：待蛋白全部溶解完后吸附，再离心除去。 石油醚：比较适合固态蛋白中脂杂质的去除。 核酸： 核酸酶：将核酸直接分解为核