蛋白质组学研究技术进展要点.pptVIP

差异蛋白质组学的研究技术 研究生： 主要内容 蛋白质组学研究背景 1、双向凝胶电泳技术 2、双向差异凝胶电泳技术 3、同位素亲和标签技术 4、同位素标记相对和绝对定量技术（重点） 蛋白质组学背景 随着人类基因组计划的完成和对基因组研究的深入，人们认识到单纯依靠基因组信息并不可能完全揭示生命的奥秘。这是因为蛋白质才是生物功能的体现者，所以必需考虑基因编码的蛋白质具有什么功能。 不仅如此，基因在转录和翻译过程中存在转录和翻译水平的调控, 蛋白质往往还要经过剪接、修饰、加工之后，最终才能成为有功能的蛋白质；而且生物体不同组织、不同分化程度和在不同环境下，所表达的蛋白质是不同的，所以单纯从基因组水平上并不能完全揭示生命活动的规律。在这种背景下，蛋白质组学应运而生。 1994年，Marc Wilkim在Siena双向凝胶电泳(two—dimen．sional electrophoresis，2-DE)会议上最早提出了蛋白质组(proteome)概念，并于1995年7月的Electrophoresis(电泳)杂志上发表。 蛋白质组学是以生物体的全部或部分蛋白为研究对象，研究它们在生命活动过程中的作用、功能。蛋白质组学较之前的基因组学对于生命现象的解释更直接、更准确。蛋白质对生命活动的直接作用比基因复杂得多．对于某一种生物或有机体来说，基因组是唯一的，而蛋白质组随细胞的种类、功能、生理状态、环境条件和病理状态而不断变化，因此仅仅从基因的角度来研究是不够的。 随着对蛋白质组学的深入理解和具体工作的开展，人们逐渐认识到在短时间内建立蛋白质组学“完整的”数据库和实现网络资源共享是难以实现的，因为条件尚未成熟。于是结构蛋白质组学研究着重于寻找和筛选任何有意义的因素引起的2个样本之间的差异蛋白质谱，揭示细胞生理和病理状态的进程与本质、对外界环境刺激的反应途径，以及细胞调控机制，同时获得对某些关键蛋白的定性和功能分析，因此，差异蛋白质组学研究技术应运而生。 1、双向凝胶电泳技术 1975 年,意大利生化学家O’Farrell （奥法雷尔）发明了双向电泳(two—dimensional gel eldctropgoresis，2-DE)技术。该技术应用两个不同分离原理为依据进行分离，即利用蛋白质分子的等电点(PI)和相对分子量的不同进行分离．第一向电泳是蛋白质的等电聚焦，根据蛋白质等电点差异进行分离，该分离技术采用固定pH梯度技术(IPG)可以实现等电点只差0．01pH单位的蛋白质的分离；第二向电泳是利用蛋白质相对分子量差异进行分离，可分离相对分子量在100×103～150×103的蛋白质。 例如：番茄种子空间搭载与地面后代叶片的差异蛋白质组研究。CK-2是对照组，MIR-2是实验组。 图1用不同裂解液裂解后的CK-2双向电泳图 左图裂解液中的去垢剂用的是CHAPS,右图裂解液中的去垢剂是NP-40。 图2 对照样品CK以及和平号搭载样品MIR 的双向电泳结果图 样品MIR-2和对照组CK-2的双向电泳结果进行了IMAGE MASTER 软件分析, 共找到了42个表达差异2倍以上的蛋白质点,对其中26个差异比较明显的蛋白质点进行了ESIQ-TOF MS /MS质谱分析, 共鉴定出10个蛋白质点, 鉴定的蛋白质在对照组均表现为上调, 在空间站搭载样品中表现为下调。 2-DE 的局限性:重复性差;自动化程度低,费时费力;对过大( 100 ku) 和过小( 10ku) 的分子量的蛋白质、低丰度蛋白质( 1000 copies) 、极酸或极碱和难溶的蛋白质如膜蛋白等分离困难。 2、双向差异凝胶电泳技术 双向差异凝胶电泳(two dimension difference gel electrophoresis,2D-DIGE)是一种新出现的荧光标记的定量蛋白质组学技术，比经典的2-DE 具有更高的动力学范围和灵敏性。该方法通过引入内标使得多个样品在一块胶上分离，进而减少了实验条件不一致引起的误差。DIGE 技术可检测到表达差异小于10％的蛋白，统计学可信度达到95％以上。 DIGE 系统基于荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)技术，是利用电荷和分子量的差异分离蛋白质混合物，并通过多通道激光扫描分析不同蛋白质的第二向SDS凝胶图像。DIGE 系统结合了新型荧光技术、样品多路技术(sample multiplexing)和图像分析等特有的技术，是一套优于经典的2-DE 的完整的系统。 DIGE的试验流程 Amersham Pharmacia Biotech, Life Science News, 7, 2001 例如：曹晓艳等利用双向差异凝胶电泳技术和质谱检测技术在“新世纪”杏的小蕾期、大蕾期、自花授粉后24h、异花授粉24h后的花柱中共检测到15