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第四章 荧光法在生物分析中的应用 Fluorescence Probes in Bioanalysis 书?? ?名??分子探针与检测试剂 作?? ?者??张华山 王红 赵媛媛 出 版 社??科学出版社 书?? ?号??03-009763-7 丛??? 书??分析化学新方法新技术丛书 责任编辑 操时杰 开本 A5 出版时间 2002年8月 字数 475千字 装??? 帧 平装 印张 0 带??? 盘 否 页数 479 蛋白质、核酸、多糖的荧光标记 荧光标记物和荧光探针 有机荧光染料 荧光纳米粒子 绿色荧光蛋白 为什么要标记？ Fluorescein 丹磺酰氯 例一 FITC 荧光素也存在一些缺点如荧光素共轭体不稳定, 荧光测试仪的强激光, 使之发生不可逆转的光漂白,导致荧光信号的迅速下降。荧光素在水溶液中以离子形式存在, 吸收及荧光性质易受pH值影响。与标记物共轭连接后, 易发生猝灭。 Rhodamine 6G (555 nm) Rhodamine B (565 nm) 罗丹明染料分子呈刚性平面, 有较高的荧光量子产率, 故荧光较强, 已成为商品化染料但位移较小,吸收区域的低能量部分与发射区的高能量部分重叠, 导致染料的激发辐射损失。 例二 例三 丹磺酰氯(二甲氨基萘磺酰氯)是一种强荧光剂，可用于测定肽链的氨基末端，它能专一地与链N-端α-氨基反应生成丹磺酰-肽，后者水解生成的丹磺酰-氨基酸具有很强的荧光，可直接用电泳法或层析法鉴定出N-端是何种氨基酸。 溶于丙酮，苯，二恶烷等有机溶剂，不溶于水。 DNS-Cl 350 nm / 520 nm 对溶剂的极性敏感。 一、蛋白质的活性功能团 1、氨基（赖氨酸?-氨基，N-末端?-氨基） NH2(CH2)4CH(NH2)COOH 赖氨酸 所有 的蛋白质和多肽都含有氨基，而且它们较易发生反应，所以通过氨基进行化学修饰是实现蛋白质标记的最常用的方法。 2、巯基（胱氨酸、半胱氨酸） 半胱氨酸的巯基的亲核性比氨基强，pH 中性时反应活性很高。 3、羧基、酚羟基 羧基、酚羟基在水溶液中反应活性一般较低。 标记过程 利用蛋白质的活性功能团对蛋白质进行标记 标记后不影响蛋白质的功能， 标记后对荧光分子的荧光性质影响不大。 1. Amine-Reactive Probes fluorescein-5-isothiocyanate (FITC Isomer I) 二、标记蛋白质的有机荧光染料 异硫氰基荧光素 理想pH 8~9 fluorescein-6-isothiocyanate (FITC Isomer II)  异硫氰基荧光素 Oregon Green? 488 carboxylic acid  Rhodamine Red?-X, succinimidyl ester  N-羟基琥珀酰亚胺（NHS） 理想pH 9~9.5 4-dimethylaminoazobenzene-4-sulfonyl chloride (dabsyl chloride)  磺酰氯 高活性基团，在水中不稳定，与许多基团（氨基，巯基，酚羟基，咪唑）反应，选着性差． Texas Red? sulfonyl chloride  Spectra — Texas Red-BSA conjugate Absorption and fluorescence emission spectra of the Texas Red conjugate of bovine serum albumin (A-23017) in pH 7.0 buffer. ???????????????????????????????????????????????? Cy3 and Cy5 are reactive water-soluble fluorescent dyes of the cyanine dye family.（花青染料） 1989 Cy3 is excited maximally at 550 nm and emits maximally at 570 nm, in the green part of the spectrum; quantum yield in PBS buffer is 0.04 FW=766. Cy5 is excited maximally at 649 nm and emits maximally at 670 nm, in the far red part of the spectrum; quantum yield is 0.28. FW=792. They are also used to label proteins and n