10-DAB分析方法验证方案.doc

10-去乙酰基巴卡亭III生产和过程控制及成品中 含量测定和杂质测定方法（HPLC）的验证方案 前言： 在红豆杉枝叶及其提取物中存在包括10-去乙酰基巴卡亭III（以下简称10-DAB）在内的大量紫杉烷类化合物，它们种类繁多，性质（特指色谱分离情况）各异，有些物质的性质极为接近，有些物质的性质又相差甚远，尤其对10-DAB而言，其在HPLC中往往出峰较早，在含量分析时除要保证10-DAB本身不受相近物质干扰外，还必须考虑与其性质相差很大、色谱上相距很远的相关物质的分析测定。经过前期的摸索，我们确定了方法的基本条件，可同时运用于从红豆杉枝叶、10-DAB起始原料、10-DAB生产过程控制到10-DAB成品中的10-DAB含量测定，也适用于其中杂质的测定。根据样品中10-DAB的含量，将样品分为两类，并采用不同方式计算： a. 10-DAB成品：10-DAB的含量≥95%。10-DAB含量测定采用单级标准的外标法；杂质和相关物质的测定采用面积归一化法。 b. 生产和过程控制样品：包括红豆杉枝叶、10-DAB起始原料、中间体等，10-DAB的含量＜98%。10-DAB含量测定采用多级标准的外标法；杂质和相关物质同法测定，计算时引入相应因子。 以下将根据要求对方法进行验证。 一、 验证目的： 通过方法的专属性、线性与范围、准确度与回收率、精密度、定量限、耐用性的验证，证明样品中的10-DAB和杂质按方法测定，能够被有效检出，且准确度、精密度、专属性、线性等均符合要求，从而确认该方法可用于10-DAB生产和过程控制及成品的含量测定和杂质测定。 二、仪器及分析条件、参数： 1、分析条件、参数： HPLC条件 参数 仪器 HPLC，四元泵或二元泵、配DAD或VWD检测器 分析柱 ZORBAX SB-CN （规格： 250×4.6mm，5um） 溶剂 色谱级甲醇 检测波长 227nm 柱温 20℃ 流动相 三元泵（水、甲醇、乙腈）或二元梯度洗脱 进样量 10 ul 流速 1ml/min 运行时间 70min 2、方法测定要求： 2.1 对10-DAB低含量样品（＜98%），其10-DAB含量以建立的多级标准曲线测定和计算，样品溶液中的10-DAB浓度要求控制在标准曲线范围内； 2.2对10-DAB高含量样品（≥95%），其10-DAB含量以前后标准为依据测定和计算，样品和标准溶液的10-DAB浓度均为约1.0mg/ml； 2.3 10-DAB高含量样品中相关物质以1.0mg/ml样品溶液测定，按面积归一化法计算。 三、仪器、试剂、样品： 1、仪器： 1.1液相色谱系统：两台，一台为四元泵，用于验证三元梯度流动相；一台为二元泵，用于中间精密度和二元梯度流动相验证。 1.2色谱柱：两支不同批号的色谱柱。 1.3百万分之一天平。 2、试剂： 2.1甲醇（色谱级）； 2.2乙腈（色谱级）； 2.3纯水：电导率＜0.1us/cm； 2.4乙酸（分析纯）。 3、对照品：标示明确纯度的标准品： 3.1标准品： 3.1.1 7-木糖基紫杉醇（7-Xylosyipaclitaxel）； 3.1.2 10-去乙酰- 7-木糖基紫杉醇（10-Deacetyl-7-xylosylpaclitaxel）； 3.1.3巴卡亭Ⅲ（BaccatinIII）。 3.1.4 10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-Deacetylbaccatin III）； 3.1.5 10-去乙酰基紫杉醇（10-Deacetylpaclitaxel）； 3.1.6紫杉醇（Paclitaxel ）； 3.1.7三尖杉宁碱（Cephalomannine）； 3.1.8 10-去乙酰-7-差向紫杉醇（10-Deacetyl-7-epipaclitaxel）； 3.1.9 7-差向紫杉醇（7-Epipaclitaxel）。 四、方法验证： 1、各相关物质相对响应因子（f）的测定： 1.1程序： 1.1.1测定：分别配制浓度为1.5mg/ml、1.0mg/ml、0.5mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml、0.01mg/ml和0.0005mg/ml的（10-DAB+紫杉醇+三尖杉宁碱+10-去乙酰-7-差向紫杉醇+7-差向紫杉醇+巴卡亭Ⅲ+1-羟基巴卡亭I + 7-木糖基紫杉醇+ 10-去乙酰基紫杉醇）混合标准溶液，每个浓度进样3次，记录10-DAB及各相关物质峰的保留时间RTi和峰面积Ai。 1.1.2计算：按下式计算各物质相对于10-DAB的相对保留时间RRTi和相对响应因子fi。 RTi 相对保留时间RRTi = ———— （