第五章-药用植物原生质体培养要点.pptxVIP

第五章 原生质体培养与体细胞杂交 教学内容 1.掌握原生质体的概念，了解原生质体培养的发展史 2.掌握原生质体的分离途径和纯化方法；掌握原生质体活力测定方法； 3.掌握原生质体培养的方法、原生质体融合方法、杂种细胞筛选及杂种植株鉴定方法。 原生质体（Protoplast）概述 原生质体概念：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。 1880年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast)一词。 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。 1971年，Takebe et al.首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。 1985年，Fujimura et al.第一例禾谷类作物－水稻原生质体培养再生植株。 1986年，Spangenberg et al.单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。 原生质体培养发展简史 　据统计，目前全世界已有49个科，160个属的367种植物经原生质体培养得到了再生植株。其中成功报道最多的是茄科，其次是豆科、禾本科、菊科、十字花科、伞形科等。 我国的发展概况： 原生质体培养的再生植株:烟草、胡萝卜、矮牵牛 原生质体融合：小麦×蚕豆、小麦×玉米、水稻×豌豆 第一节、原生质体分离及纯化 1. 原生质体分离 双子叶外植体 愈伤组织 多数植物分离原生质体的经典材料－叶肉细胞 温室生长的植物，叶片干净幼嫩，是较好的材料来源。 无菌苗的叶片更具优势。 上胚轴和子叶 1.1 材料来源 禾本科植物： 　愈伤组织或悬浮细胞。 材料预处理 用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。☆ 龙胆试管苗的叶片用4oC处理较好。☆ 甘蔗植株必须先在黑暗下培养12h后分离的原生质体才能分裂。☆ 马铃薯试管苗叶片需在黑暗下处理48h后分离原生质体，才能获得高产量。 1.2 分离方法 机械分离法 酶法分离法 1.2.1 机械分离法（Mechanical isolation） 机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。 机械分离法的优缺点 优点：能排除酶对原生质体的破坏作用 缺点： 局限性大，只限于能够广泛发生质壁分离的组织，不能从成熟的和分生细胞分离原生质体； 原生质体的产量低；得到的原生质体有限； 方法繁琐费力。 1.2.2 酶法分离（Enzymatic isolation） 酶法分离：指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。 酶分离法使用的酶 种类：纤维素酶类、果胶酶类、半纤维素酶类、 崩溃酶、 蜗牛酶 果胶酶：是从根霉、黑曲霉中提取的,使细胞间的果胶质降解,把细胞从组织内分离出来。 纤维素酶：是从绿色木霉中提取的，降解细胞壁中纤维素的酶。 酶 来源 生产厂家 果胶酶类 Macerozyme R-10 根霉 Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan Pectinase 黑曲霉 Sigma Chemical Co. Pectolyase Y-23 黑曲霉 Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan 半纤维素酶 RhozymeHP-150 黑曲霉 Rohm and Hass Co., Rhiladelphia, UAS 酶 来源 生产厂家 纤维素酶类 Onozuka R-10 绿色木霉 Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, Japan Cellulysin 绿色木霉 Calbiochem.,San Diego,CA 92037, USA Driselase Irpex lutens Kayowa Hakko Kogyo Co., Tokyo,Japan 酶液的配制 渗透压稳定剂 酶的配比及浓度 酶解液的组成及浓度 酶的混合液 　纤维素酶（1%-2% 浓度）、果胶酶（0.2%- 0.5%浓度）等。 渗透稳定剂　促进酶解，保持原生质体的完整性。 　甘露醇、山梨醇、葡萄糖等， 适宜的浓度为450-800 mmol/L。 盐类　增加膜的透性（氯化钙、氯化镁）。 酶组合、浓度 材料 纤维素酶 半纤维素酶 崩溃酶 果胶酶 离析酶 蜗牛酶 研究者 烟草叶片 禾谷类叶片 油菜花粉 马铃薯子叶 马铃薯花粉 1.0 2.0 1.0 1.0 1.0 0.5 1.0 0.1~0.2 0.5 0.5 1.0 Uchimiya Scott 李仕琼 戴朝曦 王蒂 几种草本植物原生质体分离使用的酶种类及浓度(%) 材料 纤维素酶 半纤维素酶 崩溃酶 果