东师实验5脲酶的制备及其生物学性质的研究要点.docVIP

综合研究性实验五： 脲酶的制备及其生物学性质的研究 一.实验目的 1.学习大豆脲酶的提取方法； 2.掌握脲酶米氏常数Km的测定方法； 3.掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的方法； 4.测定脲酶的活力单位及此活力； 5.测定温度、PH、抑制剂对酶活性的影响。 二.脲酶提取液的制备 脲酶提取液的制备方法 方法 锥形瓶内加入大豆粉2g和30%的乙醇20mL 30min充分摇匀，放置于冰箱 次日离心15min（3000rpm），取上清液即为脲酶提取液 说明 大豆粉中含脲酶不均一，酶浓度需作预实验稀释或酌情加量，原则上要求尿素浓度最大的一管的光吸收值在0.5-0.7为宜。另外，脲酶需新鲜配制，本实验脲酶提取液的制备最好在0-5℃下进行，在室温下放置不应超过12h，在冰箱内放置不应超过24h，否则会影响实验结果。 三.脲酶Km的测定 ?[一]实验原理 Km值一般可看作是酶促反应中间产物的解离常数。测定Km在研究酶的作用机制、观察酶与底物间的亲和力大小、鉴定酶的种类及纯度、区分竞争性抑制与非竞争性抑制作用等研究中均具有重要的意义。 当环境温度、pH值和酶的浓度等条件相对恒定时，酶促反应的初速度v随底物浓度[S]增大而增大，直至酶全部被底物所饱和达到最大速度V。反应初速度与底物浓度之间的关系经推导可用下式来表示，即米氏方程式： 对于Km值的测定，我们通常采用Lineweaver-Burk作图法，即双倒数作图法。具体做法为：取米氏方程式倒数形式。 若以1/v对1/[S]作图，即可得下图中的曲线，通过计算横轴截距的负倒数，就可以很方便地求得Km值。 本实验从大豆中提取脲酶，脲酶催化尿素分解产生碳酸铵，碳酸铵在碱性溶液中与纳氏试剂作用，产生橙黄色的碘化双汞铵。在一定范围内，呈色深浅与碳酸铵的产量成正比。通过分光光度计所得到的光吸收值可代表酶促反应的初速度（单位时间所产生的碳酸铵含量与光吸收值成正比）。具体反应如下： （1）酶促反应 （2）呈色反应 [二]实验试剂 1.0.05mol/L尿素溶液 2.0.1mol/LpH=7.0Tris-HCl缓冲液 3.10%ZnSO4溶液 4.0.5mol/LNaOH溶液 5.10%酒石酸钾钠溶液 6.钠氏试剂 将碘化钾75g，碘55g，蒸馏水50mL以及汞75g，置于500mL锥形瓶内，用力振荡约15min，待碘色消失时，溶液即发生高热。将锥形瓶浸在冷水中继续摇荡，一直到溶液呈绿色时止。将上清液倾入1000mL量筒内，并用蒸馏水洗涤残渣，将洗涤液也倾入量筒中，最后加蒸馏水至1000mL，此即为母液。使用时取母液15mL加10% NaOH溶液70mL及蒸馏水13mL混合即成。 [三]操作步骤与实验结果 加入试剂量单位为mL 试管编号 0 1 2 3 4 0.05mol/L尿素 0.25 1.00 0.50 0.40 0.25 每管中尿素的mol数 ? ? ? ? ? 蒸馏水 0.75 — 0.50 0.60 0.75 PH=7Tris-盐酸缓冲液 3.00 3.00 3.00 3.00 3.00 25℃恒温水浴，预温5min 脲酶提取液 — 0.10 0.10 0.10 0.10 煮沸的脲酶 0.10 — — — — 25℃恒温水浴，准确作用10min 10%ZnSO4 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.5mol/LNaOH 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 充分混匀，过滤 另取5支试管，与上述离心管对应编号，如下操作 上清液 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 蒸馏水 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 10%酒石酸钾钠 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 钠氏试剂 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 混合均匀，以对照管调零，在480nm处，读取各管的A480nm值 A480nm值 ? ? ? ? ? 以酶促反应初速度的倒数为纵坐标（以1/ A480nm代替），以保温混合液中脲酶提取液浓度，以mol数计的倒数为横坐标，按双倒数作图法，求得Km值 1/ A480nm ? ? ? ? ? 1/[S] ? ? ? ? ? Km ? 参考数值Km ? *[S]=每管中尿素的mol数/4.1mL×10-3（4.1mL为酶促反应总体积） 说明：（1）米氏方程系线性方程。酶促反应初速度v与光吸收值A成正比，所以用1/A代表1/v作图求Km值，方法简便，且结果不受影响。 （2）本实验为酶的定量实验，因此，酶促反应所要求的底物及酶的浓度、酶作用的条件及时间要求严格掌握，所加试剂量必须准确。 （3）试管应洁净干燥，否则不仅会影响酶促反应，而且会使钠氏试剂呈色混浊。 （4）加钠氏试剂时应迅速准确，立即摇匀，马上比色，否则容易混浊。实验中加入