DNA凝胶电泳常用试剂配制课题.doc

DNA的凝胶电泳 1.琼脂糖凝胶电泳 含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围 凝胶中的琼脂糖含量〔％（w/v）〕 线状DNA分子的有效分离范围（kb） 0.3 5－60 0.6 1－20 0.7 0.8－10 0.9 0.5－7 1.2 0.4－6 1.5 0.2－3 2.0 0.1－2 常用电泳缓冲液 缓冲液 使用液 浓储存液（每升） Tris-乙酸（TAE） 1×:0.04mol/L Tris－乙酸 0.001mol/L EDTA 50×:242g Tris碱 57.1ml冰乙酸 100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-磷酸（TPE） 1×:0.09mol/L Tris-磷酸 0.002mol/L EDTA 10×:108g Tris碱 15.5ml 85％磷酸（1.679g/ml） 40ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-硼酸（TBE）a 0.5×:0.045 mol/L Tris-硼酸 0.001mol/L EDTA 5×:54g Tris碱 27.5g硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 碱性缓冲液b 1×:50mmol/L NaOH 1mmol/L EDTA 1×:5ml 10mol/L NaOH 2ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) a．TBE浓溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液，出现沉淀后则予以废弃。 以往都以1×TBE作为使用液（即1：5稀释浓贮存液）进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖凝胶电泳都以1：10稀释的贮存液作为使用液。 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳使用的1×TBE，是琼脂糖凝胶电泳时使用液浓度的2倍。聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，故通过缓冲液的电流通量通常较大，需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。 b. 碱性电泳缓冲液应现用现配。 凝胶加样缓冲液 缓冲液类型 6×缓冲液 贮存温度 Ⅰ 0.25％溴酚蓝 0.25％二甲苯青FF 40%(w/v)蔗糖水溶液 4℃ Ⅱ 0.25％溴酚蓝 0.25％二甲苯青FF 15％聚蔗糖（Ficoll）（400型；Pharmacia）水溶液 室温 Ⅲ 0.25％溴酚蓝 0.25％二甲苯青FF 30％甘油水溶液 4℃ Ⅳ 0.25％溴酚蓝 40%(w/v)蔗糖水溶液 4℃ Ⅴ 碱性加样缓冲液 300mmol/L NaOH 6mmol/L EDTA 18%聚蔗糖（Ficoll）（400型；Pharmacia）水溶液 0.15%溴甲酚绿 0.25％二甲苯青FF 4℃ 使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品浓度，以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利；含有在电场中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖凝胶中泳动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBE作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5－1.4％的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。 选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚蓝更为鲜明。 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳 DNA 在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围 丙烯酰胺〔％（w/v）〕a 有效分离范围（bp） 二甲苯青FFb 溴酚蓝b 3.5 1000－2000 460 100 5.0 80－500 260 65 8.0 60－400 160 45 12.0 40－200 70 20 15.0 25－150 60 15 20.0 6－100 45 12 a. N,N’-亚甲基双丙烯酰胺占丙烯酰胺浓度的1/3. b. 给出的数字是迁移率与染料相同的双链DNA片断的粗略大小（核苷酸对） 30％丙烯酰胺： 丙烯酰胺 29g N,N’-亚甲基双丙烯酰胺 1g 加水至100ml 将溶液加热至37℃使化学药品溶解 小心：丙烯酰胺是强烈的神经毒素，可经皮肤吸收。丙烯酰胺的作用具有累积性。称取粉末状丙烯酰胺及亚甲双丙烯酰胺时必须带手套和面具。取用含上述化学药品的溶液也要戴手套。尽管可以认为聚丙烯酰胺无毒，但鉴于其中可能含有少量未聚合的丙烯酰胺，故仍应小心处理。 10％过硫酸铵 过硫酸铵 1g 加水至10ml 可在4℃保存数周。 制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂的体积（总体积100ml） 试剂 制备不同浓度（％）凝胶所用试剂的毫升数 3.5％ 5.0％ 8.0％ 12.0％ 20.0％ 30％丙烯酰胺 11.6 16.6 26.6 40.