发酵工程实验讲义2015要点.ppt

发酵工程模块—上游实验 贾彩凤 2015.5 实验目的 进一步理解微生物生产过程的工艺原理，熟悉生产过程。 掌握微生物发酵罐的结构和操作方法。 学习发酵过程中指标的意义及控制，对微生物生产过程有总体的认识。 实验材料 轮枝链霉菌（Streptoverticillium mobaraense）； 菌种特性：好氧菌；以无性孢子或菌丝片断进行繁殖； 发酵生产微生物谷氨酰胺转胺酶(MTGase) 。 TG酶的应用 发酵实验流程图 发酵罐和培养基的灭菌 菌种活化 三角瓶扩大培养 发酵罐清洗与检查 斜面菌种 发酵培养基的配制 加入到发酵罐中 接种 取样 发酵罐发酵的同时，用完全相同的条件，在摇瓶中做平行对照实验。 发酵液 冷冻离心，取上清，冰箱保存 超滤 酒精沉淀 SDS电泳 粗滤 相关知识介绍 1. 培养基 孢子培养基、种子培养基、发酵培养基 2.种子的制备 孢子的制备，种子的制备，菌龄，接种量 1.调整期 2.对数期 3.稳定期 4.衰亡期 茂原链霉菌生长曲线 相关知识介绍 3. 液体深层培养的几个关键点 灭菌 温度控制 通气和搅拌 相关知识介绍 4. 四联罐介绍 3L 的发酵罐，由罐体、空压机、主机、水源组成。 本实验用的发酵罐 谷氨酰胺转胺酶(MTGase)的发酵 轮枝链霉菌接种量：5～10％（v：v） 培养条件：温度，30℃；搅拌转速为200rpm；通气量，3vvm（通气量与发酵液体积比-VVM）；培养时间：40h左右 。 监测发酵罐的T、通气量、搅拌转速等状态，按照一定时间取样。 测定发酵液的pH、酶活、甘油含量和生物量。 发酵罐的取样 发酵罐监测：T、搅拌转速、通气量，记录在发酵批报上包括取样时间和取样者姓名。 100ml（150ml）的锥形瓶进行取样约20ml 发酵液的测定：pH、酶活力、菌体干重、甘油含量 注：实验需要每次做三个平行对照，即n=3，数据表示成 mean±SD 形式。 摇瓶平行实验 所有摇瓶(250ml)在发酵罐接种时进行接种（2.4ml菌种液/30ml培养基），以发酵罐的同样条件摇床振荡培养。 发酵罐取样的同时取该组的1个摇瓶，测定相应的指标。 一、 谷氨酰胺转胺酶发酵批报 罐批________ 接种时间____年____月_____日 放罐时间____年____月_____日 取样时间 培养时间 pH 罐温℃ 搅拌转速rpm 通气量L/min 生物量mg/100ml 甘油含量 酶活性 U 值班签名 TG的成熟过程—（选做实验） TG酶在发酵过程中经历pro-TG到TG的转化，其中pro-TG的分子量在45~50KD,而TG的分子量在40KD左右。 TG酶在发酵初期，大部分以pro-TG的形式存在，随着发酵的进行而转化成成熟的TG酶。 因此，可以检测不同发酵时间TG酶的存在形式，即不同时间的发酵液，取40ul上清，后用10ul 的5*的蛋白loading buffer混合后，100℃煮沸5min，后-20℃保存，等取样结束后统一进行SDS电泳，根据蛋白条带的位置跟踪TG酶的成熟。 发酵工程下游实验-酶的提取与纯化 1.实验目的： 对发酵产物进行纯化及浓缩，最终制得高浓度的酶液。 2.酶分离纯化总的原则： 用最少的步骤而能取得最好的纯化效果，因为增加步骤势必增加酶的丢失。 在低温下操作（在冰浴中），减少酶的变性失活。 3.对纯化步骤评价 收率高且纯化倍数高 4.酶纯度的检测 每个纯化步骤前后必须留2ml的样品，进行最终的SDS电泳。 MTG酶的特性 1.水溶性 2.胞外酶 3.分子量4万Da左右，为球状构型 ，单聚链 ，由331个氨基酸构成。 4.PI= 8.9 几个概念 酶活=U/ml 总酶活U=酶活（U/ml ）×体积（ ml ） 蛋白浓度=ug/ml 比酶活（U/g）=酶活/蛋白浓度×106 收率=步骤后总酶活/步骤前总酶活 纯化倍数=步骤后比酶活/步骤前比酶活 发酵液 注:每个步骤都要进行蛋白质浓度和酶活等的测定。 冷冻离心，取上清，冰箱保存 超滤 30000Da的膜 酒精沉淀 SDS电泳 粗滤 0